Echipament de laborator - rubeola

Video: sticlărie de laborator

Obținerea antiseruri. Tehnica obtinerea antiseruri antigene virale descrise în detaliu Habel și Salzman (1972). Animalele cele mai convenabile pentru antiser împotriva virusului rubeolei precum și împotriva majorității virușilor, este un iepure. Cea mai comună schema immunizatsii- introducere triplă în vena urechii cu 5 ml de fluide conținând virusuri cu intervale de 2-3 săptămâni. Iepurii au fost sângerați la o săptămână după ultima injecție. Lichidul de cultură utilizat pentru imunizare nu trebuie să conțină cantități mari de proteine. Pentru a prepara un astfel de lichid monostrat de celule infectate spălate cu grijă din mediul precedent și apoi introdus mediu de întreținere care nu conține ser, care este utilizat pentru imunizare.
În laboratorul nostru, pentru a produce cantități mari de zer utilizat cu succes de oaie (RG Desyatskova, EF Opochinsky, 1973). Imunizările au fost realizate în triplicat folosind o tulpină de virus-2 rubeolei Sp. Atunci când prima și a doua imunizare, virusul a fost injectat în vena simultan și intramuscular la o doză de 3,3 8,1H108 pfu, iar al treilea - numai intravenos în doză 4,2H108 pfu. Periodicitatea prima și a doua administrare a virusului au fost de 3 săptămâni, iar între al doilea și al treilea - de 1 săptămână. Animalul sângerat 7 zile după ultima injecție. Titrurile Antigenagglyutininov în ser este 512-1024.
Izolarea și identificarea virusului rubeolei. În practică, virologie poate avea pentru a izola virusul de la pacient nas sau rubeola sânge. În laboratorul nostru, utilizarea de echipamente dedicate și identificarea ulterioară a virusului rubeolei, deșeuri RG Desyatskovoy.
Tampoanele cu descărcare rinofaringiană plasate în tuburi sterile conținând 3 ml de soluție Hanks conținând 0,5% gelatină, 1000 U / ml penicilină, 500 U / ml streptomicină și 20 U / ml nistatină. Manipularea a lua mucusului din nas ar trebui să fie, de asemenea, de dorit energichno- care iau mucusului din nas, care se introduce în fiecare nară pentru un tampon de bumbac câteva minute. Sângele a fost luat de la un deget sau dintr-o venă în tuburi cu heparină uscat. Probele au fost transportate la laborator în gheață și în caz de necesitate inainte de studiu au fost depozitate la -40 ° C.
Semănatul sa efectuat pe probe din cultura tubului de testare a celulelor Rk13. Celulele insamantarea la fiecare doză a tubului de test a fost de 120 000-150 000 celule în 1 ml de mediu 199 conținând 10% ser bovin. Inocularea a fost realizată după formarea monostratului, de obicei în 3-4 zile. La fiecare tub s-a adăugat 0,5 ml de material din nazofaringe și sânge de 0,1 ml. Pe fiecare eșantion prelevat 3-4 tuburi. După o oră de contact la temperatura camerei, în tub s-a adăugat 1 ml de mediu 199 cu 6% dintr-un ser încălzit tratat bovin caolin și se incubează la 35 °. Pentru a se adapta și acumularea culturilor de virus inoculată au fost pasaj orb 3-4 la fiecare 8 până la 10 zile.
Indicarea și identificarea virusului rubeolei a fost realizată prin interferența cu virusul stomatitei veziculare (VSV), în aceeași cultură celulară. Permițând BBC virusul la o doza de 100-320 TCD 50 au făcut 7-9 zile după infectare cu agentul de test. Reacția rezultă după 48-96 ore în considerare, atunci când tuburile de control care permit virusului au cauzat o degenerare clară. În culturile care prezintă rezistență la acțiunea forțelor aeriene ar putea sugera prezența interferarea agent viral. .
Pentru identificarea tulpinilor virale izolate folosite ovine din ser hiperimunitate imunizați cu virusul rubeolei (cm. Mai sus). Puteți utiliza, de asemenea antiser de orice origine. Serul a fost diluat 1: 8 au fost amestecate cu un volum egal al virusului testat la o diluție de 1: 10 și incubate timp de 2 ore la temperatura camerei. Mediu a servit diluție de 0,5% lactalbumina în soluție soluție Earle. Pentru fiecare cultură tub celule Rk13 au fost adăugate la 0,2 ml de ser și a virusului și incubate timp de o oră la temperatura camerei (cultura fluid înainte de a fi scos). Tuburile au adăugat apoi la mediu 199 conținând ser bovin tratat caolin 2%, iar cultura a fost incubat la 35 °. După 7 zile de incubare, fluidul de cultură îndepărtat și tuburile au fost adăugate ml de virus într-o doză care permite 100-320 TCD50 diluat cu același mediu. Reacția a fost considerată după apariția degenerare în cultura de celule de control. Prezența efectului citopatic în cultura experimentală a probelor de ser neutralizant specific virusului. Simultan, serul a fost testat pentru toxicitate și doze au fost monitorizate de operare virus permisivă.

Laboratorul nostru a fost aplicat cu succes la modul „clasic“ de indicație și identificarea virusului rubeolei, folosind culturi primare de rinichi de maimuță verde și ca permițând ECHO virusului și (Parkman e. A., 1964b), cu toate acestea, în opinia noastră, această tehnică nu este potrivit pentru practica obișnuită de virusologie.
metode de identificare bazate pe observarea directă a efectului citopatic al virusului rubeolei, sunt rar utilizate pentru detectarea tulpinilor de virus circulant, ca tulpini de „sălbatic“ nu fac în mod normal, efectul citopatic în cultură fără adaptare prealabilă. Manifestari CPP virusul rubeolei depinde, în general, destul de pretentios si de multe ori pe tulpinile de celule, o serie de mass-media, serurile, etc, E. Aceasta ne-a oferit un motiv pentru a recomanda pentru izolarea virusului metoda indirectă.
Titrarea virusului. Titrurile de virus Rubella ambelor metode indirecte bazate pe interferența și directă, bazată pe efectul citopatic observate direct. Metoda de titrare indirectă poate utiliza procedura descrisă mai sus în descrierea indicației virale. Este necesar doar pentru a include etapa de preparare a diluțiilor zecimale ale virusului. Ca mediu de suport după inoculare culturilor de celule în diferite diluții de virus mediu 199 conținând 2% ser bovin caolin tratat utilizat. Pentru titrului luând cea mai mare diluție care protejează 50% din culturile infectate de degenerare cauzate de virus permisive. Titrurile de virus sunt exprimate InDso / ml (doza de interferență).
Pentru titrarea virusului prin metoda directă, folosind culturi de celule expuse la CPE virusul rubeolei. Cel mai adesea este Rk13 (Hopps e. A., 1969), mai puțin Sirk și BHK21. De obicei, tubul conținând cultură Se pipetează 0,2 ml de diluții de zece ori adecvate ale virusului și după contactul timp de o oră la temperatura camerei mediu de menținere. Pentru a lua cel mai mare titru de diluție al efectului citopatic virus face ca 50% din culturile inoculate (TCD50).
În laboratoarele de cercetare pentru titrarea virusului rubeolei este utilizat pe scară largă prin analiza pe placă. Cel mai des folosite pentru aceste scopuri celule Rk13. Pentru laboratoare practice, această metodă este oarecum complicat, deci nu vom da o descriere detaliată și va limita legăturile respective (RG Desyatskova, OG Andzhaparidze, 1968- Hopps e. A., 1969).
Studii serologice. Izolarea virusului rubeolei - o procedură foarte consumatoare de timp și este puțin probabil să fie difuzate pe scară largă. Din motive practice, o valoare mult mai mare sunt testele serologice. Le puteți utiliza pentru câteva zile pentru a confirma diagnosticul de rubeola, investiga statutul imun al unui anumit grup populație, pentru a stabili eficacitatea vaccinărilor și așa mai departe. E. Anticorpii la virusul rubeolei sunt detectate în reacțiile de neutralizare (pH-ul), inhibarea hemaglutinarea (HI), fixarea complementului ( RAC) si imunofluorescenta (IFA). În practică, ocurența cea mai răspândită datorită simplității sale, specificitatea și viteza rezultatelor obținerea. Aici este o descriere detaliată a acestei reacții.
inhibiția hemaglutinare. HI virusul rubeolei prima dată descrisă de Stewart et al, în 1967. Noi am găsit o modalitate de a elimina ser inhibitori de hemaglutinare virusul rubeolei stabil la căldură, care sunt |. 3-lipoproteine. În acest scop, serul utilizat în reacție, se tratează cu o suspensie de 25% din caolin. In laboratorul nostru este folosit în principal o metodă ușor modificată a acestor autori. Examinând mai mult de 10.000 de seruri, putem recomanda aceasta metoda ca fiind destul de precisă și cel mai accesibil pentru laboratorul de virusologie al țării noastre.
Ca solvent soluție tampon dextroză-gelatină-veronal (JW).
Caolin. suspensie de caolin 25% a fost preparată prin Clarke și Casals (1958) prin metoda de spălare de patru ori în tampon fosfat pH soluție 7,2. O porție de 250 g de caolin a fost amestecat cu 750 ml de soluție tampon, scuturate viguros și lăsat să se stabilizeze. După înlocuirea procedurii de supernatant se repetă cu soluție proaspătă. Suspensia finală a fost autoclavizat timp de 30 minute la 115 atm. și apoi depozitate la 4 °. Înainte de utilizare, soluția tampon de fosfat a fost înlocuită cu o sumă DZHV egală.
Eritrocite. Preferăm celulele roșii din sânge de porumbei adulți, dar, de asemenea, să ia puilor de o zi eritrocite. La puii sunt sângerat prin decapitare, și de la porumbei donatori - din inimă. In acest caz porumbeii iau simultan 5 ml de sânge într-o seringă cu 5 ml soluție Alsevera. Sânge până la utilizare (de obicei, în decurs de o săptămână) stocată în soluția Alsever la un raport de 1: 10, 1: 20. Înainte de a utiliza eritrocite se filtrează și se spală de trei ori într-o cantitate DZHV de zece ori prin centrifugare secvențială timp de 10 min la 1200 rot / min. Din precipitatul preparat suspensie eritrocitar 0,25% pentru reacția și suspensia a fost de 50% pentru tratamentul serurile.
procesare seruri. Serurile de testare pentru a elimina inhibitori nespecifici pentru prevenirea aglutinare spontane și încălzite la 56 ° C timp de 30 min și se tratează cu caolin și eritrocite. La 0,1 ml de zer încălzit se adaugă 0,3 ml dintr-o suspensie de caolin 25% și se incubează amestecul la temperatura camerei timp de 20 minute, agitând viguros de câteva ori. După aceea, amestecul a fost centrifugat timp de 15 min la 2000 rot / min și, fără să sugerea supernatant, s-a adăugat suspensie eritrocitare 0,05 ml 50%. După o oră de contact de la 4 °, timp în care celulele roșii din sânge trebuie să fie de 2-3 ori mai agită ușor, amestecul a fost centrifugat din nou la 1500 rot / min timp de 10 min. Procedura centrifugarea poate fi înlocuită prin incubare la 4 ° C peste noapte. Serul supernatant este diluat 1: 4.
Declarația HAI. Reacția este efectuată în macro- și micromodifications. La formularea panourilor makrometodom de reacție sunt puțuri din plastic cu o capacitate de 1,5 ml. Mikrometodiku efectuat folosind microtitrare Takacs firmă "Metrimpeks" (Ungaria). În titrare de preparare a antigenului de lucru suspensie hematiilor și diluții DZHV folosit testul seruri conținând albumină bovină 0,2%, care trebuie adăugată pentru a stabiliza reacția. În absența unei bovine albumină posibilă utilizarea albumină din plasmă umană, globulină derivate din producția de deșeuri, plasmă sau soluție de albumină pentru administrare intravenoasă (Desyatskova G. R. și colab., 1971).
Deoarece macro și microreaction efectuate în mod identic, o descriere makroreaktsii, iar volumul de ingrediente, introduse la microreaction, pus în paranteze. Atunci când antigenul este titrat pentru a determina doza de operare de două diluții din suspensie eritrocitare 0,4 (0,05) 0,25 ml-% este introdus într-un volum de 0,2 (0,025) ml. Toate ingredientele sunt răcite
Dă la 0 g. într-o baie de gheață. Rezultatele permit 1,5-2 h de incubare la temperatura de 4 °. La o diluție de antigen în microreaction mai bine să se utilizeze un micropipete. Titrul antigen ia cea mai mare diluție care provoacă aglutinarea distincte. doza de antigen care lucrează în HI formulare conține 4 unități.
două diluții ale serului de test se realizează într-un volum de 0,2 (0,025) ml. Pentru fiecare diluție de ser a fost adăugat 0,2 (0,025) ml de diluție a antigenului de lucru, amestecul a fost lăsat să stea timp de o oră la temperatura camerei și apoi se adaugă 0,2 (0,025) ml 0,25% suspensie eritrocit răcită în gheață. Reacția s-a lăsat timp de 2-3 ore de incubare la temperatura de 4 °.
La formularea antigen ser micrometodă reacție contact mai bun și se menține la 4 ° C, timp de 2 ore, deoarece rezultatele reacției realizată prin această metodă într-o mai mare măsură depinde de respectarea modului de răcire.
titru seric este considerată cea mai mare diluție de hemaglutinare complet copleșitoare. Serul este considerat negativ în cazul în care suprimarea aglutinare nu se observă la o diluție de 1: 8.
Fiecare serie de titrare este însoțită de controale corespunzătoare: titrarea serului imun cu un ser negativ titru de anticorpi cunoscut, serul de control și a celulelor roșii din sânge în prezența aglutinare spontane. Pe parcursul ultimelor două controale, lipsa de componente adecvate compensa volumul corespunzător al JW. Este de dorit să se utilizeze apă bidistilată.
În prezent, nu există nici o metodologie standard pentru stabilirea virusului rubeolei HI, care ar fi nivelat rezultatele obținute în diferite laboratoare. Mai multe modificări ale acestei reacții, esența care constă în principal în utilizarea diferitelor metode de tratament seruri pentru a elimina inhibitori non-specifici precum utilizarea diferitelor tampoane și eritrocite.
Pe lângă eliminarea inhibitorilor prin adsorbție pe caolin, larg utilizate seruri precipitare cu un amestec de heparină și clorură de mangan (Cooper e. A., 1969a) și recent găsește aplicare de prelucrare seruri cu un amestec de sulfat de dextran și clorură de calciu (DS-C) (Haukenes, Aasen, 1971).
Ca soluții tampon, cu excepția DZHV utilizați tampon borat cu% albumină 0,4 (Babs) - Aceeași soluție a fost amestecată cu soluție salină tamponată cu fosfat (Babs + PBS) (.. Halonen th, 1967) și cel mai recent și HEPES tampon sau HEPES albumină și gelatină (HSAG) (Schmidt e. a., 1971).
De remarcat că, unele nou-a propus modificarea HAI. Astfel, Gupta și Peterson (1971) a dezvoltat o tehnica de aplicare a eritrocitelor formalizate folosind sistem- Schmidt și Dennis (1972) a folosit eritrocite umane noul bufferul grup 0 având o serie de avantaje în practică Quinn primenenii- et al. (1972), propus prin tratamentul cu tripsină eritrocitelor umane care crește sensibilitatea lor și deschide noi posibilități pentru standardizarea reacției.
Utilizarea crescândă a se testat pentru macroglobulina ser (IgM, anticorpi 19S). Acest test poate confirma diagnosticul de rubeolă într-o singură zi, deoarece prezența IgM specifici în ser este un indiciu al infecției cu curent. Cea mai simplă metodă de determinare a IgM, deși cel mai puțin exacte, este de a trata seruri de 2-mercaptoetanol (2-ME) (RG Desyatskova, E. F. Opochinsky, 1973- Banatvala e. A., 1967).
Serul a fost tratat cu 2-ME (concentrație finală de 2-ME - ODM), timp de o oră la 37 ° și apoi testate în HAI condusă în maniera obișnuită. În paralel, același ser este crescută, dar nu sunt tratate cu 2-ME. 2-ME distruge IgM și, prin urmare, diferența în titrurile de anticorpi determinate în probele de ser luate înainte și după tratamentul cu 2-ME poate fi judecat
prezența IgM. Acesta este considerat autentic prin diferență de cel puțin patru ori în credite.
metode mai sofisticate de identificare macroglobulină sunt centrifugare într-un gradient de sucroză (Field, Murphy, 1972), gel filtrare (Burgin-Wolff e. A., 1971) și imunofluorescență indirectă (Haire, Hadden, 1972), dar aceste metode nu sunt destul de utile într-o largă practică din cauza complexității lor tehnice. Din acest motiv, nu vom da o descriere detaliată și o referință pentru a restricționa detectarea anticorpilor împotriva prin reacția de neutralizare (Parkman e. A., Furesz e 1964. A., 1969- Kobayashi e. A., 1973), fixarea complementului ( Sever e. a., 1965) și prin imunofluorescență (Brown e. a., 1964).
În prezent, există în mod clar necesitatea de a dezvolta o metodologie standard pentru stabilirea testelor serologice (cel puțin HAI) și în producția de componente standard pentru producțiile lor, ceea ce ar crește acuratețea rezultatelor și ar simplifica foarte mult organizarea de anchete serologice în masă.

Video: Nemiroff - sticlărie, vas petri și tubul de testare 2 în 1

Video: Echipamente de laborator și articole din sticlă 31