Tehnici de diagnostic imuno - lupus eritematos sistemic, sclerodermia sistemica, artrita reumatoida

Video: Conferința "Tehnologii personalizate in reumatologie"

CAPITOLUL IV
ELISA pentru diagnosticul de tulburari ale sistemului imunitar
Linked immunosorbent assay este una dintre zonele mai rapida dezvoltare a Enzimologie chimice. Acest lucru se datorează faptului că în această metodă o specificitate unică test imunochimice combinată cu detecție ridicată sensibilitate de etichete enzimatice. Stabilitatea ridicată a reactanților, ușurința metodelor de înregistrare sunt avantajele incontestabile ale metodei care contribuie la aplicarea largă în medicină.
Metoda constă în legarea anticorpilor respectivi compușii definiți specific. Metodele clasice de immunoassay bazate pe formarea antigenului cu anticorpi în prezența unui precipitat (peleți). Indicarea complexului antigen-anticorp format în soluție poate fi realizată, dacă voi într-una dintre componentele de pornire ale sistemului de reacție să se introducă o etichetă, care este determinată cu ușurință prin metode fizico-chimice corespunzătoare extrem de sensibile. În acest scop, se aplică izotopic, enzimatice, etichete fluorescente, paramagnetici, utilizarea pe care a făcut posibilă pentru a crește sensibilitatea metodelor imunochimice în milioane de ori, și pentru a reduce timpul de analiză la câteva ore.
Pentru a efectua o astfel de analiză este necesar să se efectueze o separare eficientă a complexelor de componente libere. Această problemă a fost ușor de rezolvat, în cazul în care o componentă a perechii antigen-anticorp este ferm imobilizat pe un suport solid. Imobilizarea pentru a preveni agregarea în soluție și de a realiza separarea fizică a complexelor imune formate din componente libere.
Noi metode imunochimice bazate pe utilizarea reactivilor marcați, au constatat o largă acceptare pentru determinarea cantitativă a compușilor biologic activi foarte diverse structuri - de la low-molecular-moleculara mare hormoni virusuri și celule întregi.
Cea mai mare dezvoltare dintre ei a fost radioimunoanaliză, așa cum a propus la sfârșitul anilor '50. Cu abilitatea de a defini o etichetă care este un izotop al 1-125, în concentrații foarte mici, a fost posibil pentru a realiza o analiză de sensibilitate ridicată. Dezvoltarea acestei tehnici a fost un punct de cotitură în dezvoltarea metodelor de analiză imunochimice, a pus bazele pentru o serie de metode diferite care utilizează compuși marcați. Pentru dezvoltarea metodei, autorii Yalou R. și S. Berson în 1977 au primit Premiul Nobel.
Împreună cu avantajele metodei radioimunoanaliză are neajunsurile sale, care includ costul ridicat al echipamentelor și insecuritate de mediu legate de posibilitatea de contaminare radioactivă a mediului, cu punerea în aplicare a unui număr mare de teste și necesitatea unor măsuri de precauție speciale și personal cu înaltă calificare. Este aceste dificultăți au fost punctul de plecare pentru căutarea de alternative la radioimunotestare, dar își păstrează o sensibilitate ridicată, specificitate și expresivitatea.
În ultimele decenii, metode de analiză imuno intens dezvoltate, atât din punct de vedere teoretic și practic, și până în prezent au fost formate într-o direcție științifică independentă, având aplicații importante. Folosirea suporturilor solide pentru adsorbție sau imobilizarea covalentă a anticorpilor, urmată de legarea specifică a compusului testat în immunosorbent și detectarea complexelor imune formate prin intermediul componentelor marcate cu enzime pentru a începe metodele de fază solidă (heterogen) imunoenzimatică.
Aceste metode sunt cele mai comune și sunt folosite pentru a determina o gamă largă de atât cu greutate moleculară mică și compuși moleculară mare - anticorpi, peptide, antigeni virali și bacterieni, agenți farmacologici.
De o importanță deosebită pentru introducerea pe scară largă a ELISA a fost dezvoltarea în practică ca purtători pentru imobilizarea adsorbția anticorpilor și antigenelor polistiren plăci specific conținând 96 godeuri. Fapt sorbție la anticorpii de suprafață de polistiren a fost stabilit la mijlocul anilor '60 și folosit inițial în metodele radioimunotestare. Punerea în aplicare în practică a unei enzime imunotestare plăci din polistiren ne permite să simplifice procedura metodică pentru punerea sa în aplicare. dispozitive speciale care automatizează etapele de adăugare a reactivilor pentru a efectua spălarea și înregistrarea simultană a activității catalitice a etichetei enzimei în fiecare dintre găurile de bord au fost construite.
Cele mai frecvente scheme de teste imunologice enzimatice sunt după cum urmează: competitivă tehnica, secvențială de saturație, „sandwich“ -Metoda și metoda de determinare a antigenelor cu anticorpul antispecies marcat.
Principiul imunoanalizei competitiv este determinat prin adăugarea simultană a antigenului și a anticorpilor marcați cu enzime, aducerea sistemului la echilibru și apoi măsurarea eticheta enzimei în complex cu anticorpul sau antigenul marcat nelegat.
Spre deosebire de imunoenzimatică competitivă, tehnica de saturație secvențială se bazează pe interacțiunea secvențială a anticorpilor cu mai întâi determinată, apoi cu un antigen marcat enzimatic. Analiza este posibilă în două moduri. In primul caz antigen marcat se adaugă direct la incubările alt amestec care conține anticorpul și proba de testare. În al doilea caz se administrează antigen (posibilă numai atunci când se utilizează ELISA) immunosorbent după prima reacție de la complexele nelegate au fost spălate și apoi etichetate. Această metodă evită efectul inhibitor posibil al componentelor investigate într-un fermentmarker fluid biologic. Concentrația de conjugat legat de anticorpi este proporțională cu concentrația inițială și antigenul este caracteristic conținutului său în eșantion.
„Sandwich“ -Metoda se bazează pe utilizarea anticorpului specific imobilizat și marcat și este una dintre cele mai comune abordari pentru analiza antigenilor polivalenți. Metoda există în mai multe versiuni. Cea mai larg acceptată presupune doi pași. Primul antigen definit reacționează cu anticorpii imobilizați, apoi se spală și se adaugă anticorpul marcat enzimatic imunoabsorbant, amploarea legării care cu determinanții de antigen liber proporțional cu concentrația inițială. substrat secundar se spală și se înregistrează numărul de tag-uri asociate cu imunoabsorbant.
O metodă competitivă folosind anticorpi antispecies marcată- permite determinarea diferitelor antigene (atât mono- și polideterminantnye) folosind aceiași anticorpi marcați. Testul a fost realizat după cum urmează. antigenul K imobilizat pe un suport, se adaugă este determinată și anticorpul specific antigen. In timpul incubarii, antigenele imobilizați sunt determinate și în competiție pentru locurile de legare de anticorp. Ca rezultat, purtătorul este format complex antigen-anticorp, în care concentrația de anticorp este proporțională cu concentrația inițială a antigenului. După îndepărtarea componentelor nelegate în exces, se adaugă la suportul de anticorpul antispecies marcat enzimatic care formează un complex cu anticorpi specifici. După îndepărtarea excesului marcat concentrației de anticorpi mărci înregistrate pe suportul. Astfel, metoda combină principiile concurenței și „sandwich“ -Analiza.
Firește, pentru toate aceste metode trebuie să fie legată testul de imunosorbție pentru anticorpi la substrat desemnat. Astfel, un punct important este de a obține antiseruri și anticorpi policlonali. În acest scop, utilizat în prezent animalele imunizate adjuvant Freund, urmată de izolarea și purificarea anticorpului, adică îndepărtarea anticorpilor nespecifici. În unele realizări, o imunoenzimatice folosind conjugati enzimă nu cu toată molecula de imunoglobulină, și astfel un fragment al acestuia care se leagă specific la o moleculă de antigen, Fab-fragment.
antiseruri policlonale au adesea o înaltă reactivitate încrucișată care face dificil sau chiar imposibil pentru ei să folosească în imunoanaliză. Avantajul principal al anticorpilor monoclonali este posibilitatea de a obține cantități nelimitate de identice de la lot la caracteristicile fizico-chimice lot. Proprietatea principală, care se bazează pe utilizarea anticorpilor monoclonali este o interacțiune foarte specifică. Utilizarea anticorpilor monoclonali în „sandwich“ - modificarea reduce timpul analizei.
Nivelul de anticorpi a colagenului de tip I și fibronectina pot fi determinate prin mai multe metode: immunofluorestsetgnym imunoenzimatică, metode imunoelectroforeza rachete și aglutinare. Dintre acestea, metoda ELISA are avantaje în simplitatea, disponibilitatea de utilizare, precizie și fiabilitate. De aceea, majoritatea rezultatelor studiilor de anticorpi la colagen și fibronectină, obținute prin metoda imunoenzimatică.
Pentru a investiga nivelul de anticorpi a colagenului de tip T, iar fibronectina prelevarea de sânge imunoreactiva totală se realizează în tuburi de polipropilenă. Tuburile pentru determinarea fibronectinei se adaugă 3,8% citrat de sodiu anticoagulant la un raport de sânge la anticoagulant de 1: 9 în volume. trasilol adăugat într-o cantitate de 40 ED / ml Pentru a preveni scindarea proteolitică a fibronectinei la o soluție de anticoagulant. Sângele trebuie centrifugate imediat timp de 15 minute la 3000 rot / min. Serul și plasma obținută este transferată la EPPO plastic Dorf, congelate și depozitate la tt-20 ° C Înainte de analizele eșantionului nu trebuie decongelate pentru prevenirea fibronectina-C, care este o molecula de digerat (Morrink și colab., 1985). Timpul de prelevare a probelor de ser și plasmă pentru eșantioane înainte de analizele care efectuează nu trebuie să depășească 6 luni.
Anticorpii la colagen tip I a fost determinată prin testul de imunosorbție legată de enzimă (ELISA) folosind nativ tip heterolog colagen (Katsuyuki F. et Michiko T.).
Nativ de tip colagen I este folosit pentru imobilizarea pe plăci de polistiren «Libro plastice» Company (SUA). Colagenul este introdus în godeuri la 200 l în 0,01 M tampon fosfat pH 7,4. Plăcile au fost incubate timp de 15-18 ore la temperatura de t ± 4 ° C, apoi se spală în mod repetat cu apă de la robinet, conținând 0,05% th secretă 20 și introdus în godeuri, 200 pl din probele de ser diluate 1: 1000 în soluție salină tamponată cu fosfat pH 7.2. Probele au fost incubate în godeuri timp de 30 de minute la t ± 37 ° C Godeurile au fost spălate din nou ca mai sus, și fiecare dintre ele a fost adăugat cu 200 ml de anticorp conjugat cu peroxidază protivokollagenovyh în diluția de lucru. Conjugatul a fost incubat timp de 30 min la t ± 37 ° C și, după spălarea plăcilor din fiecare godeu face 200 l de amestec substrat, constând dintr-o soluție 0,0015% de peroxid de hidrogen și 0,01% m ortofenilendiamină în tampon de citrat de sodiu 0,05M pH 4,7. După incubare timp de 10 min la temperatura camerei, reacția a fost stopată prin adăugarea a 50 pl în godeurile de acid sulfuric 50%. Intensitatea culorii a amestecului de substrat se măsoară la o lungime de undă de 492 nm.
Ca o comparație, o probă de ser bazin luat obținut de la 100 de donatori. Rezultatele sunt determinate prin formula:
A - A / Tc • 100, unde Tk - titrului proba sravneniya-
Că - titrul probei.
nivel total fibronectina plasmatic este determinat prin metoda lui G. A. Ermolina prin ELISA în „sandvich- modificări“.
Rabbit fibronectina anti-uman utilizat pentru imobilizarea pe plăci de polistiren ( «Libro Plastics»). Anticorpii sunt realizate în godeuri în 200 M carbonat pl tampon pH 0,01 9,6 (10 mg / ml proteină). Plăcile au fost incubate timp de 15-18 ore la 4 t
O curbă de calibrare standard a fost preparat folosind fibronectina care se diluează la o curbă de calibrare în soluție salină tamponată cu fosfat cu 0,05% - m Tween 20 pH 7,2-7,4. Ca rezultat al analizei seriei obținute curbelor de calibrare reprezentate grafic în coordonate, valoarea extincție - numărul de fibronectina selectat porțiunea liniară a curbei standard, care cuprinde următoarele cantități de fibronectina: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 nm / ml. Conținutul fibronectinei în probele test ale plasmei din sânge determinate de o curbă de calibrare etalon. fibronectina diluție standard pentru a construi o curbă de calibrare preparată pentru fiecare placă.
Fiziologic plasma moleculă fibronectina capabilă de legare să pună în aplicare activitatea opsonică numai în cazul în care există cel puțin un cuptor liber explozie la colagen (EngvaJl E. și colab, 1977). Astfel, o molecula fibronectinei are un domeniu de 2 - unul în fiecare subunitate (D&rsquo-Ardenne A. și colab., 1984). Astfel, prin determinarea nivelului de fibronectina plasmatic total este imposibilă cu suficientă certitudine judecător activitatea funcțională a moleculelor sale, deoarece reacția este detectată pe baza determinării epitopilor specii.
Determinarea Ziua imunoreactiv fibronectinei plasma ELISA folosit o modificare în care ,, în plăci de polistiren imobilizat anticorp nu este ca „sandwich metoda“, iar 1% - th soluție de gelatină, care se leagă de fibronectină prin intermediul domeniului colagenic. Astfel, pentru a determina o tabletă cu moleculă fibronectina plasma gelatină să reacționeze doar pe faza solidă având domeniu liber „lipicios“ la colagen. Ca un standard utilizat plasmă proaspătă de la donatori sănătoși cu un conținut cunoscut de fibronectina plasmatic total. Calcularea conținutului de fibronectina plasmei imunoreactiv în probele se calculează după cum urmează:
K = 1 - (x - N / x), unde K - numărul de fibronectina plasmei imunoreactiv exprimată în unități arbitrare uzuale
x - Extinction obraztsa-
N - plasma donor Extinction.