Diagnosticul genetic molecular

Video: Diagnosticul genetic molecular al bolilor. În cazul în care este limita posibilităților noastre?

Separat gena sau segmentele de ADN mai scurte nu pot fi vizualizate sub examen microscopic, totuși aplicate pentru identificarea mutațiilor prin diagnostic genetic molecular. Informațiile obținute de la „Proiectul genomului uman“, si alte progrese in genetica moleculara au extins foarte mult capacitățile de pre- sau post-natale diagnosticul bolilor genetice. Metode de diagnostic molecular genetice asigura depistarea precoce si prognosticul debut bolilor mono și poligenice la maturitate. capacitățile tehnice de diagnostic molecular genetice pot merge dincolo de limitele etice impuse asupra bolilor ereditare, mai ales dacă aceste studii ar trebui să fie efectuate în copilărie și adolescență.

Video: Mikhailenko DS - diagnostic molecular genetice moderne in urologie

Metode de citogenetică molecular

anomalii cantitative si structurale ale cromozomilor - cauze comune de numeroase defecte de dezvoltare și a cancerului. Identificarea acestor aberații cromozomiale este importantă în consiliere familială pentru prognosticul și riscul de reproducere la sarcinile viitoare. Analiza cromozomială tradițională - „standardul de aur“ de diagnosticare citogenetice, dar are o capacitate limitată. Metode de diagnostic molecular genetice cu utilizarea de etichete fluorescente, care sunt bazate pe tehnologii de clonare, iar sensibilitatea crescută de conjugate de anticorpi facilita identificarea modificărilor cromozomiale subtile nu detectate de studiul citogenetic clasic. Astfel de tehnici de a spori capacitățile de diagnosticare atunci cand examineaza copii cu retard mintal, handicap de dezvoltare si multe alte boli.

Video: Borovlyany descoperi laboratorul genetic molecular

Fluorescența metoda de hibridizare in situ

hibridizare fluorescenta in situ (FISH - hibridizare in situ fluorescenta) implică utilizarea unei secvențe de nucleotide unice ale ADN-ului ca o sondă pentru a găsi secvențe ADN specifice din materialul obținut de la pacient. Lokusspetsifichesky sau sondă ADN genspetsifichesky marcat cu un marker specific (de exemplu, un fluorocrom) pentru a permite detectarea cu microscopie de fluorescență. ADN-ul Investigat este un preparat cromozomial pentru examenul microscopic, care cuprinde un fir în metafază și nucleele interfazice (în stare divid). sonda ADN și ADN-ul țintă a fost denaturat, conducând la formarea de ADN monocatenar. Sonda ADN se adaugă la prepararea cromozomilor și incubate pentru o perioadă de timp suficientă pentru hibridizare a sondei ADN și secvențe ADN complementare ale pacientului în cazul în care pacientul are o întindere de ADN complementar la sonda ADN. Hibridizarea are loc numai pe regiunile de ADN complementare și nu se referă la fragmentele cu alte secvențe de ADN de la alte parti ale genomului. Prezența sau absența unei sonde marcate cu fluorocrom care constă din ADN după hibridizare în studiul cromozomului determinat prin microscopie cu fluorescență. Rezultatul acestei metode de diagnostic molecular genetice, ca regulă, este dincolo de orice îndoială.

Video: Genetica și Nutriție

Avantajele metodei FISH diagnostic molecular-genetice includ analiza rapidă a unui număr mare de celule, sensibilitate și specificitate mare, capacitatea de a investiga non-celule culturable și se divid. Cu această metodă este posibil de a investiga celulele conținute în secțiunile de parafină. Dezavantajele sunt că este imposibil să se obțină informații despre starea fizică a ADN-ului țintă sau regiunea cromozomului. Efectuarea FISH necesită cunoștințe locus implicat în aberațiilor cromozomiale și selectarea sondei ADN corespunzătoare care poate detecta această aberație. FISH nu este utilizată ca o metodă de screening de diagnostic genetic molecular. Metoda este folosită pentru a obține un răspuns la o întrebare specifică (pentru a determina prezența sau absența presupusei mutație specifică). De obicei, se completează metodele clasice de cromozomi colorare, și este principalul mijloc de identificare a cromozomilor în metafaza sau interfază și secvențe de nucleotide specifice ale ADN-ului care stau la baza anumite boli (fenotip).

FISH este folosit in diagnosticul genetic molecular prenatal si pentru a caracteriza utilizarea sa pediatrie opuholey-, de obicei, pentru a identifica deleții submicroscopice asociate cu malformații specifice. Sindroamele, care se bazează pe microdeletions, o dată considerată o boală de etiologie necunoscută, sub formă de deleții cromozomiale și de ajustare, determinând dezvoltarea acestor boli nu sunt de obicei redate metode tradiționale de analiză cromozomiale. Stergerile mici în regiuni cromozomiale specifice pot fi identificate cu precizie ridicată prin FISH. Pentru bolile cauzate de deleții submicroscopice includ sindromul Prader-Willi, Angelman, Williams, Miller-Dieker, Smith Madzhenis și sindromul velokardiofatsialny. FISH facilitează diagnosticarea acestor sindroame în circumstanțe neobișnuite, mai ales în fază incipientă, atunci când nu există multe semne semnificative diagnostician ale bolii. Aplicarea acestei metode de diagnostic molecular-genetic, este recomandabil in adolescenta si la maturitate, când semnele clinice tipice ale bolii specifice copilariei, se schimbă.

Subtelomericheskie remaniere

In cele mai multe cazuri, translocarea implica capetele de cromozomi (telomerii). Un număr mare de gene care stau la baza sindroame ereditare se manifestă sub forma unor malformații, localizate în regiunile adiacente telomeres in zonele cromozomi subtelomericheskih. Screening-ul telomerilor pentru a identifica rearanjamente cromozomiale este o metodă valoroasă pentru identificarea mutațiilor cromozomiale submicroscopice și rearanjamente nu sunt detectabile cu analiza standard de cromozomi. FISH, utilizat pentru detectarea rearanjamente cromozomiale submicroscopice la pacienții cu retard mintal, se concentreaza pe identificarea mutațiilor localizate la anomaliile cromozomiale capetele subtelomericheskie sunt detectate la aproximativ 7,5% dintre acești pacienți.

hibridizarea genomică comparativă

Comparative hibridizare genomică (CGH) - este aplicarea metodei FISH pentru a genomului de screening larg pentru a identifica diferentele in numarul de copii ale oricăreia dintre secvențele de nucleotide ale ADN-ului la pacient. CHS a fost dezvoltat pentru studii genetice in domeniul oncologiei (tumori solide primare), dar acum este folosit pentru a determina localizarea materialului genetic sau a pierderii exces de regiuni cromozomiale cu anomalii cromozomiale putative. Aceasta metoda de diagnostic genetic molecular cuprinde amestecarea și hibridizarea simultană de cantități egale de diferiți coloranți testați marcate ADN (de exemplu, marcat cu un colorant fluorescent verde) și ADN-ul normal de referință (de exemplu, colorant fluorescent roșu) cu filamente normale în metafază. Rezultatul este un anumit raport de fluorescență verde și roșu. In acest test sunt detectate zona de amplificare a ADN-ului (copierea multiplă) ca zone de concentrare excesivă a zonei de depunere colorant verde - ambele zone roșii reflectând ADN de testare deficiență și un raport egal al testului și ADN-ul normale sunt câmpul de culoare galbenă. Astfel, CHS oferă o hartă a secvențelor ADN de nucleotide în genomul. Avantajele acestei metode de diagnostic molecular genetice este posibilitatea aplicării sale la orice tesut. Metoda nu poate detecta anomalii cromozomiale echilibrate, în care numărul de copii ale ADN-ului nu se schimba. Rezoluția metodei nu permite identificarea copiei cromozomiale de o dimensiune mai mică de 10 MB, iar numărul de copii se schimbă, dacă pierderea de cromozomi sau cromozomice excesul de material conține mai puțin de 50% din celulele analizate.

cariotiparea spectrale și FISH multicolore

capabilități Limitarea CHS în identificarea unei rearanjamente cromozomiale echilibrate este umplut folosind colorarea multicolore de cromozomi cu o singură hibridizare. metode legate de analiza genetica moleculara, care sunt capabili de a identifica rearanjamente cromozomiale echilibrate - karyotyping și FISH multicolor (M-FISH) spectrale. In ambele metode, diagnosticul genetic molecular, fiecare dintre cromozomi în metafază etichetat culoare specifica care pot vizualiza simultan întregul set de cromozomi. Cromozomul 24 sondă marcată cu fluorocrom și 5 sunt utilizate în combinație, ceea ce duce la crearea de circuite combinatorii, în care fiecare dintre cele 22 de autozomi precum axele X și Y Cromozomul vopsite in diferite culori. M-FISH necesită utilizarea seturilor specifice de filtre pentru fiecare din cele 5 flyuorohromov- prin spectroscopie spectrală karyotyping aplicate și interferometer pentru evaluarea modelelor de emisie fluorescenta. Aceste metode permit să dezvăluie rearanjamente cromozomiale complexe, translocarea mici de cromozomi și marcate. Dezavantajele metodelor includ incapacitatea de a identifica deleții mici sau duplicări intrahromosomnye și inversiune pericentric sau paracentric.

Metode de analiză ADN

Metode citogenetice moleculare crește capacitățile de diagnostic pentru detectarea deletii cromozomiale sau duplicări (conținând zeci sau sute de gene). Alte metode de analiză ADN-ului pot dezvălui modificări ale genelor individuale. Efectuarea analizei ADN-ului este posibilă în legătură cu faptul că ADN-ul - este o moleculă relativ stabilă, care poate fi izolat din orice celule nucleate și salvate pentru studii suplimentare. Cel mai frecvent izolate din ADN leykotsitov- alte materiale folosite în acest scop includ celulele amniotice si vilozități coriale (cu diagnostice prenatale), celule derivate din accident vascular cerebral cu mucoasa bucală și fibroblastele obținute dintr-o biopsie a pielii. Când gard aceste țesuturi este de obicei posibil să se izoleze o cantitate suficientă de ADN. Metode moderne de diagnostic molecular genetice, cum ar fi reacția în lanț a polimerazei (PCR), permite amplificarea ADN-ului obținut din toate una sau mai multe celule.

, Western, Northern blot Southern

Analiza Southern blot - aceasta este prima metodă de diagnostic molecular-genetic la nivel molecular. Acum în mare parte înlocuit metode bazate pe PCR, și secvențierea directă a ADN-ului. Folosind analiza Southern blot, ADN genomic izolat de către pacient și se taie în fragmente mici folosind endonucleazele de restricție (enzime bacteriene care scindează ADN-ul la anumite site-uri strict). Fragmentele rezultate sunt separate prin electroforeză pe gel de mărime folosind agaroză, transferate prin intermediul sugativă pe un filtru de nailon stabil, fixat pe un filtru, hibridizare a fost efectuată cu o sondă ADN marcată radioactiv, urmată de autoradiografie. Aceasta metoda molekulyano diagnstiki genetică permite detectarea mutațiilor, în cazul în care modifica lungimea fragmentului ADN (situs de restricție), care se schimbă imaginea de clivaj enzimatic rezultat. Southern blot este în continuare cel mai frecvent utilizat pentru detecția genei de adeziune cu un anumit ADN polimorfism congenital. De asemenea, este posibil să se traseze răspândirea genei în alți membri ai familiei, chiar dacă defectul molecular specific asociat cu o boală ereditară, nu poate fi identificat.

Când Northern blot analizează structura și cantitatea de ARNm produsă gene specifice. ARN clivaj prin enzime de restricție imposibilă. ARN-ul transcris de lungime diferită în funcție de mărimea și numărul de exonilor din gena. Astfel, mutațiile care alterează cantitatea sau lungimea exonilor poate fi determinată ca rezultat al modificărilor ARN detectate prin Northern blot. Metodologia este identică cu Southern blot cu excepția faptului că celulele studiate ARN total sau ARNm purificat mai degrabă decât ADN-ul este scindat cu enzime de restricție.

Analiza Western blot furnizează informații cu privire la mărimea și numărul de proteine ​​mutante din extractele celulare obținute de la pacienți cu boli genetice specifice. Proteinele din extractele celulare au fost separate prin electroforeză în mărime prin gel de poliacrilamidă și transferate într-o membrană. Membrana a fost apoi incubate cu anticorpi specifici pentru proteinele. Anticorpul secundar (direcționat împotriva primul anticorp) marcat cu un colorant fluorescent Aceasta metoda de diagnostic genetic molecular este utilizat pentru determinarea prezenței sau absenței și mărimea proteinei distrofina musculare la pacienții cu distrofie musculară X-legate.

reacția de polimerizare în lanț

Cu toate că, în unele boli cele mai multe mutatii apar ca urmare a ADN-ului de ștergere mare, care sunt relevate prin analiza Southern blot, majoritatea anomaliilor de gene care stau la baza multor boli sunt mutații punctiforme. După detectarea mutației punct poate fi sintetiza ADN construct (primeri) care acoperă porțiunea afectată scurt mutație. Obtinerea suficiente copii ale ADN-ului modificat poate fi dificilă, dar PCR oferă mai multe copii ale fragmentelor de ADN specifice. Când amplificarea PCR a ADN-ului se realizează prin cicluri termice repetate. PCR a revoluționat diagnosticul mutațiilor. Este standardizat și metoda de diagnostic molecular-genetic, care pot fi efectuate pe un număr mic de probe automate. Metoda este relativ ieftin, timp de mai multe ore, se pot obține miliarde de copii ale secvențelor ADN de nucleotide specifice.

secvențierea ADN Direct

secvențiere automată ADN-ul a devenit o metodă standard de diagnosticare moleculara genetice in multe laboratoare clinice de genetica moleculara si a contribuit la progrese semnificative „Proiectul genomului uman“. secvențierea ADN-ului este deosebit de util in cazurile de gene minore și în situațiile în care mutația exactă în această familie este necunoscut. Toate modificările identificate în structura genei trebuie analizate cu atenție pentru a vedea dacă acestea sunt baza bolii, sau se referă la polimorfismului normal.