Spectroscopia Doppler cu laser de celule vii - diagnosticare cu laser în biologie și medicină

Spectroscopia Doppler cu laser a celulelor vii și diagnosticarea mobilității intracelulare

Informații generale. Pana in prezent, multe cercetări efectuate pentru a dezvolta metode și motilitatea de înregistrare practică a celulelor vii în suspensie: bacterii, animale și sperma umană, alge, etc. (a se vedea, de exemplu, [50-54]) ... Această mobilitate nu este caracterul de difuzie termică, plimbări aleatorii și elemente cu rectilinie, de rotație și mișcarea elicoidală. Fiecare dintre aceste mișcări contribuie la spectrul Doppler lărgime. Prin urmare, o descriere exactă a rezultatelor de dispersare a luminii într-un model complex de multi-parametru matematic. Cu toate acestea, procedurile dezvoltate pot fi obținute din distribuirile vitezei măsurate experimental al spectrului, numărul relativ de celule mobile și fixe și un număr de alți parametri.
Având în vedere că subiectul a publicat un număr mare de articole de revizuire (a se vedea., De exemplu, [53, 54]), nu vom discuta în detaliu, și treceți la o discuție a studiilor de mobilitate intracelulară, în care utilizarea spectroscopiei cu laser Doppler (LDS) este foarte promițătoare [55, 56].
Prima utilizare a acestei metode pentru a rezolva problemele de înregistrare vizate mobilitatea intracelulară în celulele vegetale mari se referă la 1974 [57]. Spectrele Doppler clar ce caracterizează distribuția vitezelor stabilizate au fost obținute prin particulele de dispersare a luminii care constituie protoplasma acestor celule (nuclee, mitocondrii, etc.). Intr-o serie ulterioară de lucrări [58-64] au demonstrat eficiența ridicată a LDS ca metodă regulată de rezolvare a problemelor de biofizică de mobilitate, care să permită să efectueze înregistrarea răspunsurilor celulelor nestaționare la stimuli externi, care este important în studiul mecanismelor de organizare spațială și temporală a motilității celulare și reglarea acestuia, și așa mai departe.
O caracteristică de detectare cu laser a celulelor vii unice este în continuare faptul că lumina este difuză, nu numai în mișcare organite intracelulare, dar, de asemenea, fixate pe pereții celulei. În primul caz, lumina împrăștiată apare schimbări de frecvență Doppler, în timp ce lumina difuză în a doua frecvență nu se schimbă.

Această a doua componentă este împrăștiată în mod inevitabil, lumina cade pe fotodetector, care permite folosirea acestei componente ca radiația de referință pentru transferul turele frecvență Doppler la frecvențe mai mici de heterodyning. Astfel, circuitul de detecție de fază unică poate, în principiu, asigura un mod de măsurare heterodine vitezele particulelor intracelulare. Desigur, condițiile trebuie să fie îndeplinite în mod eficient și heterodine sistem de operare, care, în unele cazuri, se face în mod automat, iar în unele efort suplimentar.

Fig. 3.11 O diagramă bloc a sistemului de măsurare și de calcul bazat pe LDS singur fascicul
Instalare Descriere. Fig. 3.11 este o diagramă de măsurare și de calcul sistem stabilit pentru studiul motilității intracelulare [65]. No-Ne radiație de LH-38 cu laser tip (/), slăbit de un set de filtre (2), focalizat de o lentilă (5), pe colivia (4) fixat în cuva (5) în suporturi speciale (6). Lumina împrăștiată trece prin sistemul de lentile și diafragmele (7) pe PMT (8), care funcționează în modul curent. Semnalul după amplificare și filtrare în amplificator LF (9) furnizat în paralel cu un osciloscop (10) pentru controlul vizual pe un timp real analizor de spectru SK4-72 tip (11) având altele decât cele de ieșire digitală indicator fascicul de electroni și convertorul analog-digital (ADC) (12), care convertește semnalul analogic în probe discrete, cu o frecvență de eșantionare stabilită de software și durata. Aceste probe sunt introduse într-un calculator (13) pentru procesarea spectrală care se execută în cursul sau după înregistrarea probei în memorie.
Toate următoarele rezultate sunt obținute prin prelucrarea semnalului pe computer UE-1010, deși ar putea fi utilizate în schimb, în ​​orice altă mașină din aceeași clasă. Pe aceeași mașină poate fi alimentat cu analizorul de spectru de ieșire digitizat și semnalele de ieșire de la alți senzori (de exemplu, indicatoare de temperatura, potențialul de membrană, sau altele asemenea.) (14). Calculatoarele echipate cu dispozitive externe: alfanumerice (15) și grafica (16) de afișare, plotter (17) și garnitură (18). O parte a complexului este un pachet software pentru achiziție și prelucrare a datelor, precum și pentru a controla experimentul.
Principalele caracteristici ale complexului, este determinată în mare măsură de specificul sarcinii și Proprietăți-
obiectelor, pot fi numite: momentul primirii spectrelor Doppler în medie cu satisfăcătoare

Fig. 3.12. Spectrul Doppler obținut dintr-un charophytes celulelor vii cu staționare peste protoplazmy- 0 = 45 °, t = 10, T = 20 ° C
o precizie (de obicei, în limita a 10%), m = 1-6 măsurarea vitezelor dincolo c- mișcării k îndreptate = 10 -1000 microni / c hardware lărgirea spectrului A / a = 0,5 Hz - 2 localitate L măsurare = 100 -500 mkm- număr posibil de măsurători Doppler canale n = 4 (în plus, pot fi introduse în calculator schimbă mai lent semnale de la alți senzori); - densitatea de putere de radiație în regiunea sondat celule W = l-100 W / cm3. Valoarea exactă a expunerii prag nondemolition este stabilit pentru fiecare tip de celule înainte de experiment în considerare măsurătorile de lungime, coeficientul de absorbție și un număr de alți factori.

Rezultatele măsurătorilor. Fig. 3.12 scală semilogaritmică este prezentată într-un aspect caracteristic spectrul Doppler obținut în măsurarea celulelor mari charophytes Nitella, nu au fost supuse influențelor externe. Forma spectrului este determinată în principal de distribuția vitezei în volumul de măsurare, și indică faptul că majoritatea particulelor se deplasează la viteze de t>= 40 m / s, corespunzând frecvenței maxime în spectrul. În viteza constantă de curgere starea de protoplasmă în aceste celule sunt fluctuații mici, astfel încât spectrul mediu poate fi realizată pentru o lungă perioadă de timp (câteva minute), ceea ce ar reduce răspândirea componentelor spectrale. Cu toate acestea, astfel de măsurători sunt interes pur metodologic, deoarece estimarea staționară a vitezei poate fi făcută prin observarea vizuală printr-un microscop optic.
un interes semnificativ mai mare, având în vedere problemele de mai sus este biofizic fenomene tranzitorii de observare quasistationarity cu un timp caracteristic de cel puțin 1 s. Cu toate acestea, trebuie să se mulțumească cu un semnal de valori considerabile de densitate de putere răspândirea spectrale, ceea ce duce la erori mari în măsurarea.
In celulele vii Nitella mișcările intracelulare tranzitorii au loc sub influențe externe :. Lumina, mecanice, electrice, chimice etc. De exemplu, stimularea electrică prin aplicarea unei tensiuni de impuls electric ns = 100 mV, durata Ti = 1 cu membrana exterioară excitabil duce la generarea potențialului de acțiune și ulterior de oprire a fluxului protoplasme rapid cu reducerea ulterioară a acestuia [64]. Corespunzător procesului schimbarea formei spectrului Doppler este prezentată în Fig. 3.13.
Când mișcarea de oprire (Fig. 3.13a) Doppler componentelor spectrale dispar și rămâne lărgită doar linia, reflectând prezența difuzie și cealaltă mișcarea nedirecțională în cușcă. De-a lungul timpului, deoarece curentul de recuperare este redusă și protoplasme Doppler componente spectrale (Fig 3,136 -. R). În funcție de parametrii externi influențează timpul pentru a ajunge la valoarea inițială a debitului poate fi de 5-10 minute sau mai mult, iar în unele cazuri se pot stabili procese pe termen lung, având un caracter oscilatoriu.

Fig. 3.14. Trei exemple ale procesului de recuperare a fluxului direcționat în protoplasma celulei după oprire rapidă (punct de oprire indicat cu o săgeată)

Fig. 3.13. Cinetica Doppler spectral formă de recuperare după oprirea temporar fluxul de protoplasmă
Cinetici diferite de refacere a mobilității intracelulare sunt prezentate în figura 3.14.
Trebuie remarcat faptul că fluctuațiile ratei observate nu sunt o manifestare a stării patologice a celulei. Perioadele de oscilație constante pentru fiecare celule specifice iau valori în intervalul de la 5 până la 10 minute, și forma vibrațiilor poate fi un quasiharmonic și aproape de relaxare. Interesant, oscilațiile de viteză sunt însoțite de oscilații în potențialul de membrană, dar acestea diferă în perioade de două ori mai mare [64]. Viteza Caracterul de recuperare depinde de condițiile de iluminare din perioada anterioară de stimulare.
Au fost făcute încercări pentru a elibera semnalul de fond general, doar lumina împrăștiate de particulele definite joacă un rol important în mecanismul de generare a forței motrice. În special, aceste particule în conformitate cu anumite ipoteze sunt sferosomy - particule sferice care conțin miozină și având un diametru de 0,8 microni 0.2-. Se presupune că particulele oscilează într-un plan perpendicular pe direcția curentului principal de protoplasmă. Astfel de mișcări lor ar trebui să genereze un semnal în spectrul vârfurilor echidistante LDR lățime proporțională cu momentul înregistrării fiecărui spectru. Distanța dintre ele în axa de frecvență în conformitate cu calculul trebuie să fie egală cu frecvența medie a oscilațiilor particulelor. Pentru a regla departe de un semnal Doppler puternic asociat cu mișcarea direcționată de-a lungul protoplasma celulei, măsurătorile au fost efectuate astfel încât q vectorul de împrăștiere este orientat perpendicular pe fluxul principal. Astfel, în plus față de spectrul componentelor semnalului dorit contribuie componentele ortogonale ale vitezei care rezultă, eventual în coliziuni în mișcare particule, precum și componente ale mișcării difuziv.
Fig. 3.15 prezintă spectrul Doppler obținut în acest circuit, în același experiment și măsurarea același volum ca și spectrul prezentat în Fig. 3.12. Spectrul a fost numeric folosind algoritmul • transformata Fourier rapidă în ceea ce privește probele de semnal discrete transmise filtrarea digitală avansată pentru eliminarea componentelor de frecvență mai mare, care ar putea denatura componentele dorite datorită aliasing frecvență. Rezoluția de frecvență este de 0,1 Hz, în timp ce primește una din spectrul - 55, care nu depășește mișcarea cvasistationar a particulelor în celulă.
După procesare și memorie 90 construit valori ale spectrului de frecvență histogramă corespunzătoare maxime bine distinse. Analiza statistică a rezultatelor efectuate prin metoda de testare ipoteze au arătat că maximele înregistrate statistic semnificative, în care discontinuitatea detectată în spectrul cu distanța medie între armonici de 3,6 ± 0,6 Hz corespunde calculului teoretic.

Fig. 3.15. Spectrul Doppler obținut în timpul înregistrării a luminii împrăștiate într-un plan perpendicular pe direcția curentului principal de protoplasmă
În același timp, a rezultatelor obținute până în prezent nu respectă legătura lor clară cu spherosome mișcare de vibrație. Pentru o astfel de conexiune ar trebui să izoleze lumina împrăștiate numai sferosomami care nu este posibil, sau să excludă alte mișcare periodică a structurilor de împrăștiere. Cercetarea în această direcție sunt în curs de desfășurare.
Pe baza datelor experimentale extensive obținute folosind LDS, un număr de modele construite mecanism de generare de conducere forță, rezultând în mișcarea charophytes protoplasmei [66].
Un alt exemplu de aplicare pentru studiul mobilitatii intracelulare LDR nestaționar se referă la mișcarea de înregistrare protoplasmă mucic ciuperca Physarum polycephalum [56, 59, 61, 67-70]. Acest obiect este în mod substanțial diferită de cea descrisă mai sus, în morfologia, natura mobilității și a proprietăților optice. In tyazhah reprezentând un strat subțire (100-500 microni) și lung (1-2 cm), tub datorită peretelui activității contractile periodic are loc în timpul alternând protoplasme cu Tv quasiperiod = 1-2 p.
Fig. 3.16 prezintă trei spectre obținute din fire cu diferite protoplasmă viteza de curgere. Spectrum 1 se obține gamă minimă pri- debit de 3 - la maximum. De remarcat este o diferență semnificativă între caracteristica spectre ale obiectului, din spectrele înregistrate din celulele de alge. Așa cum se arată prin calcule și măsurători pe modelul capilarelor [71], forma spectrelor este definit nu numai profilul vitezei în volumul de măsurare, dar, de asemenea, parametrii statistici ai luminii optice difuzând perete neomogenități mărginește fluxul. În ceea ce privește acest obiect al doilea dintre acești factori are o influență dominantă.

F, kHz
Fig. 3.16. Trei spectru Doppler derivate din Plasmodium miksomitsetov și care corespund diferitelor viteze de curgere ale protoplasme: „(/)<» (2)Se înțelege că, în conformitate cu un astfel de interval, este posibil să nu vorbesc de protoplasmă viteză primară sau cea mai probabilă, dar o anumită viteză CEF efectivă sau debit mediu determinat prin conversia din formula (3.3) semilățimea spectrului la un nivel fix.

Fig. 3.17. Timpul Dependența lățimii spectrului Doppler obținut prin mucegaiuri plasmodium mazga cu naveta peste protoplasmei
Cu toate acestea, variația în timp a acestui parametru reflectă cinetica transportului intracelular de protoplasmă.
Fig. 3.17 prezintă o dependență de timp tipică a modulului funcției IEF (i), înregistrată pe un singur fascicul
spectrometru. Fiecare punct al curbei corespunde jumătății lățimii spectrului obținut prin calcularea mediei peste 64 de spectre „instantanee“, cu un timp total de măsurare de 5 secunde.
De notat că curbele similare obținute prin LDS, atât calitativ cât și cantitativ, în conformitate cu cele obținute prin măsurarea vizuală, filmul printr-un microscop optic, dar diferă rezoluție mai mare și să conțină nici un element de subiectivitate. De asemenea, este important ca prelucrarea și prezentarea datelor sunt efectuate în timp real și la sfârșitul experimentului curbelor sunt stocate în memoria calculatorului ca o serie de numere, gata pentru prelucrare ulterioară ulterioară.
Analiza acestor curbe obținute cu diferite condiții experimentale, inclusiv cele care rezultă dintr-un senzor de multipunct pe un exemplu de realizare mai multe canale spectrometru [8, 56], a dat cele mai multe informații, care sunt utilizate pentru a construi modele ale motilității intracelular [66, 68, 72, 731. în particular a investigat influența temperaturii impacturilor cvasi-staționare și impulsiv schimbare oscilații rata perioadă de curgere TV sunt afișate posibile pentru a sincroniza aceste oscilații acțiunea externă [2, 69], datele la posibil un fel de factor, oscilatoare de sincronizare intracelular (setare elemente ritm) [8, 67] arată prezența șuvițe de lucru contractile activi, rezultând în mișcarea protoplasmei, [68], și așa mai departe. d.
microscopie Doppler cu laser. In exemplele de mai sus sunt utilizate pentru măsurarea spectrometrul ofera o sonda locala de aproximativ 100 mm, care a fost suficient datorită dimensiunii relativ mari a obiectelor studiate. Atunci când se lucrează cu celule mici, au nevoie de o rezoluție spațială mai mare - de ordinul a mai multor micrometri. Acest lucru se realizează în așa numitul microscop cu laser Doppler (LDM) prin utilizarea de scurtă optică și dispunerea geometriei speciale a elementelor [74-84]. În cele mai multe cazuri, LDM se face pe baza microscoape optice de serie, ceea ce le face, configurare ușoară compact.
Fig. 3.18 este un LDM organigrame efectuat pe baza microscop „LUMAM“ (1) conjugat cu un micro-calculator (2) și cu condiția pentru confortul setărilor camerei TV (3) și un monitor de televiziune (4) [84]. Microscop Construcție posibilă realizarea atât diferențial și circuitul singură ramură (prin suprapunerea una dintre grinzile) din totalizarea grinzilor sondei la un obiect de mai jos, fie (/) sau partea superioară (//). În primul caz fotodetector (5) detectează lumina difuză înainte, în al doilea - în urmă.

Fig. 3.18. O schemă bloc a unui microscop cu laser Doppler
Volumul de măsurare este format prin focalizare (b) și receptorul (7) și lentila pinhole (8) dispuse în fața fotodetector în planul imaginii. Astfel, prin creșterea lentile de 15 x 30 și x, iar cantitatea de deschidere 150 microni dimensiune longitudinală a volumului de măsurare ALJ = 7,5 mm, iar transversal AL2 = 2,5 m. Coeficientul de scalare privind viteza măsurată de la frecvența Doppler Shift este de 1,3 microni / (s * Hz).
Înainte de a lovi lentila de focalizare ambele grinzile trec printr-un modulatori-acustico optică controlată (9)
prin care acestea dobândesc trecerea de frecvență relativă a L /, care poate fi ajustat în intervalul 102-105 Hz. Prezența unei diferențe de frecvență y a grinzilor de sondare face LDM sensibile la direcția de curgere a testului și permite reconstruita uninformative din componentele de joasă frecvență ale semnalului Doppler [14].
procesare Schema după amplificator fotocurentul (12) include un timp real analizor de tip S4-72 (13) și / sau calculatorul (2) prevăzut cu un afișaj (15) antrenează cu discuri flexibile magnetice (16) și un plotter (17). Semnalul este alimentat la un computer după eșantionare prin unități de interfață (14) prevăzute în standardul KAMAK- Microscopul este prevazut cu VCR (18) pentru înregistrarea imaginilor TV ale obiectului.
LDM descris este destinat în primul rând pentru mișcările de cercetare îndreptate în celule, dar are o gamă mai largă de aplicații.
Cu ajutorul microscopului cu laser Doppler obținute printr-o varietate de rezultate unice. În special, mișcarea direcțională a particulelor înregistrate în interiorul celulelor somatice unice [82] O observație directă a acumulării de B-crystallin in embrion cristalinului pui [83]. Pe fundalul celulelor protoplasmă algelor flux direcțional intens detectate anizotropia coeficientului de difuzie de translație a particulelor în direcții diferite în interiorul celulei [80, 81].
Acestea și multe alte rezultate arată că LDS și LDM a devenit un instrument eficient care poate aborda o gamă largă de probleme biofizica celulare.