Fluorescenta laser Analiza - diagnostic cu laser în biologie și medicină

Video: unsprezece-12 octombrie 2011

Video: Îndepărtarea cu laser a măduvei spinării tumorilor în Israel

Capitolul 7
Analiza LASER fluorescenta
Ei bine-cunoscut o mare oportunitate care a deschis în analiza pentru cercetare biomedicală fluorescenta [1-5]. Datorită sensibilității ridicate la cantități mici de material biologic și o bună reproductibilitate a rezultatelor, această metodă a fost utilizată pentru o gamă largă de sarcini în domeniul biologiei moleculare și celulare, virologie, biofizică membranei. In medicina luminiscență este utilizat pentru diagnosticarea proceselor fiziologice esențiale pentru a controla fluxul de, și de conversie de ieșire a organismului de medicamente pentru a diagnostica un număr mare de boli de la cancer la gripa, pentru controlul calității produselor alimentare, precum și curățenia mediului și t. D.
Acest capitol arată că utilizarea tehnologiei cu laser, în unele cazuri, oferă analize luminiscent calitativ noi posibilități în celălalt - utilizarea de lasere poate crește în mod semnificativ eficiența cercetării.
După o scurtă descriere a bazelor fizice ale analizei cu laser luminescent considerate dezvoltate la mijloacele tehnice care permit data, în special, pentru a efectua măsurători cinetice cu o rezoluție spațială și temporală ridicată și informații procesate digital. Caracteristici ale metodei au demonstrat într-un număr de exemple din studiul proprietatilor macromoleculelor, celulele vii individuale și microorganisme pentru diagnosticarea tumorilor maligne și a modificărilor vasculare aterosclerotice.
În secțiunea finală oferă exemple de diagnosticare la distanță obiectelor biologice fotosintetice fluorescente de aeronavă sau navă.

Informații generale. In analiza fluorescenta laser pe baza este înregistrarea fotonilor emiși de molecule în timpul tranziției de la un electron excitat la starea solului (vezi. Fig. 5.1, 7.1). Fig. 7.1 Solul și primele state singlet excitate sunt notate cu S0 și Sl. Fiecare dintre aceste niveluri de energie poate fi compus dintr-o multitudine de subnivele vibraționale 1,2,3 și t. D. Tranzițiile între subnivele sunt indicate prin săgeți.

Fig. 7.1. Dispunerea circuitului nivelelor de energie și tranziții ale moleculei
Excitarea atomilor si moleculelor in analiza fluorescenta cu laser se produce în mod tipic prin absorbția de fotoni cu laser intervalelor ultraviolete vizibile sau aproape. Acest proces are loc într-o perioadă de timp de ordinul a luminii oscilație, adică. E. Aproximativ 10-15 secunde. În această moleculă, de obicei, este la un nivel superior de vibrație sau S2. Pe lângă moleculele în faza condensată se caracterizează prin relaxarea radiationless rapid la cel mai mic subnivel vibraționale Slt stare de echilibru termic corespunzător. Acest proces vine la un capăt, de regulă, în timpul 10-12-10"n c. suplimentare de tranziție la starea S0 este însoțită de un proces de descompunere spontană a cuante de lumină. Astfel, în cazul în care tranziția se face direct de la starea Si la starea S0, fără variația electronul se rotește, se referă la o astfel de tranziție cuantice tranziții permise mecanic. Tipic Valoarea timpului de viață a statului excitat este de 10 ~ 8 s. Acest proces se numește fluorescență intrinsecă.
În cazul în care, cu toate acestea, înainte de emisia unui foton, ca urmare a unor tranziții interne de energie este una dintre electronii moleculei schimbă spin, molecula este în stare triplet 7, trecerea de la care starea fundamentală singlet a mecanicii cuantice nu este permisă, de ex., E. Probabilitatea este foarte mică. Intervalul de timp durata de viață a acestui stat 10-8 la 102. O astfel de emisie de foton se numește fosforescență. Aceasta radiatie este de obicei deplasat spre lungimi de undă mai (energie mai mică) față de fluorescență și are o durată mult mai lungă în timpul excitație în impulsuri.
Subiectul considerația noastră în continuare va fi exclusiv fluorescenta. Subliniem faptul că emisia de fluorescență spontană este un proces aleatoriu și radiații spontane este incoerentă, spre deosebire, de exemplu, împrăștiate radiații elastic.
Multe obiecte biologice importante sunt caracterizate prin fluorescență intrinsecă sau au componente fluorescente - fluorofori. Astfel, aproximativ 90% din totalul proteinelor fluorescenței datorită prezenței triptofanului aminoacid aromatic. Proteinele absorb lumina aproape de A = 280 nm și fluoresces cel mai puternic în regiunea X = 300-350 nm. Durata de viata fluorescenta de triptofan in proteine ​​care nu se află în intervalul 1-7, în funcție de tipul de proteine ​​și structura sa terțiară. De asemenea, fluorescențe in proteine ​​aminoacizi cum ar fi tirozina, fenilalanina, cisteina și cistina. Caracteristici generale ale proteinei de fluorescență este prezentată în [6-8].
În regiunile spectrale albastre și verzi galben-fluorescențe recuperat nucleotidele piridină NADH și NADPH (>. = 440-480 nm) și flavoproteinelor oxidate (FP) (X = 510-540 nm). Aceste substanțe sunt implicate în cele mai importante procese intracelulare, cum ar fi glicoliza, ciclul Krebs, respirația. Prin urmare, aproape orice modificări ale metabolismului celular sunt afișate pe proprietățile dinamice ale NADH și OP, și ea, la rândul său, poate fi detectată cu o analiză de fluorescență a celulelor vii și țesuturi. Un astfel de exemplu, vor fi discutate mai jos.
fluorescenta naturala, de asemenea, alți co-factori, enzime, vitamine, steroizi și hormoni. Nucleotidele și acizi nucleici, de obicei, nu prezintă fluorescență. Cu toate acestea, există unele excepții. Astfel, ARNt-Phe drojdie conține bază intens fluorescente, cunoscut sub numele de Y-bază, care are un vârf de emisie aproape = 470 nm și o durată de viață de aproximativ 6 nu. In apropierea UV vizibile și regiuni ale spectrului fluorescențe cristale nucleobaze cultivate în mod artificial.
fluorescenta intrinseca în regiunea UV are un aparat contractile, mitocondrii și alte structuri intracelulare, intensitatea fluorescenței depinde de starea fiziologică a celulelor și a modificărilor cu efecte diferite asupra celulelor.

Fluorescența în regiunea roșie a spectrului datorită prezenței porfirine în celulele vii.    
Cu toate acestea, proprietățile de fluorescență naturale ale multor obiecte biologice sunt ușoare și de multe ori nu reușesc să obțină informațiile necesare de la experiment. In astfel de cazuri ca etichete sau sonde sunt folosite alte fluoroforilor naturale sau sintetizate artificial, care, deși acestea sunt străine în ceea ce privește obiectul testat, dar au cele mai bune proprietăți fluorescente. sonde fluorescente pot fi, de exemplu, caracterizarea cantitativ proprietățile fizice ale membranei, cum ar fi taxa de suprafață, potențialul de membrană, microviscosity, distanța dintre proteine ​​și lipide, concentrația apei în membranele, modificări în conformația proteinelor și colab. [7].
Utilizarea de sonde fluorescente permite diagnosticarea multor boli, in special imune, inclusiv alergii, toxicozei si ateroscleroza. Register fluorescență introdus în mod artificial în celule și organisme coloranți fluorescenți, și tetracicline precum porfirine vie, realizat, de asemenea, diagnosticul de cancer.

Video: karyotypes - de ce ar trebui să le ia

Fluorescența este întotdeauna parțial polarizată. Excitația luminii anizotrope permite să aloce agregate aleatoare de atomi sau molecule dintr-un anumit grup.
Polarizării fluorescentei poartă informații despre comportamentul moleculelor între absorbția și emisia de fotoni, orientarea moleculelor, mobilitatea și interacțiunea cu mediul înconjurător.
Orice experiment folosind analiza cu laser fluorescenta este redusă la excitație selectivă a fluorescenței obiectului testat, sau orice parte a radiației laser, măsurarea unuia sau mai multora dintre parametrii de mai sus și evaluarea rezultatelor datorită fenomenului în studiu, ca parte a unui anumit model.
Interval de timp între absorbția radiației și emisia ulterioară este suficientă pentru fluxul de o varietate de procese, fiecare dintre acestea conduce la o modificare a caracteristicilor de fluorescență observate. Aceste procese includ: .. coliziune cu fluorescență inactivare (de exemplu, moleculele de oxigen), prin difuzie de rotație și translație, formarea de complexe cu un solvent sau un solut etc. Ca rezultat, înregistrarea spectrelor, vieți, randamentele cuantice și anizotropiei fluorescenței oferă o mai mare informații cu privire la astfel de procese dinamice.

Video: pașaport genetic!