Absorbție și analiza de transmisie folosind lasere acordabile - diagnosticare cu laser în biologie și medicină

Metoda ABSORBȚIE ȘI calorimetrică
DIAGNOSTIC
La decizia unui număr de probleme de diagnostic în biologie și medicină sunt dovedite metode de absorbție, care sunt frecvent utilizate în spectroscopie laser și spectroscopie analitică a proceselor ultrarapide [P. 1 - P. 3 P. 40 - P. 43, 1,12, 1]. Aceste tehnici se referă la metode mikrodiagnostiki, deoarece acestea utilizează informații despre structura atomica si moleculara a obiectului biologic substanta. Reprezentarea schematică a unor metode mikrodiagnostiki este prezentată în Fig. 5.1. În cazul general, metodele de absorbție includ atât absorbția și transmisia, bazată pe măsurarea intensității incidentului / „și trecut / lumina diferite lungimi de undă, și metode bazate pe înregistrarea energiei absorbite prin măsurarea încălzirii temperaturii AT bioobject (metode opto calorimetrică) sau intensitatea / f fluorescenta (analiza fluorescenta laser) sa.
Deoarece analiza cu laser fluorescenta, astfel cum este aplicată biologiei a primit foarte răspândită și are o valoare independentă, aceasta va fi discutată într-o secțiune separată, după cum se va discuta aici metode posibile de absorbție și de transmisie, precum și perspectivele pentru utilizarea metodelor optice calorimetrice. metodele de diagnostic de absorbție Clasificare și unele modificări ale acestora sunt prezentate în Schema 2.

Analiza de absorbție și de transmisie
folosind lasere acordabile

Procedura de măsurare, limitarea sensibilității. Măsurarea spectrului de transmitere a materiei în diferite stări de agregare este baza unei metode spectrofotometrică, care a fost folosit cu succes de mai mulți ani în diferite domenii ale științei, inclusiv biologie si medicina. Acesta este caracterizat prin simplitate extremă, versatilitate, sensibilitate relativ ridicată și acuratețea analizei, este suficient pentru a rezolva multe probleme de biomedicina.

2. Metode de diagnostic de absorbție Clasificare și unele modificări ale acestora

Fig. 5.1. Reprezentarea schematică a unui număr de metode mikrodiagnostiki
Măsurarea spectrului de transmisie bazată pe intensitatea înregistrării incidentului (/ 0) și intensitatea mediului absorbant transmis în r direcția luminii (/), în funcție de lungimea de undă de la:
(5.1)
(5.2)
și în care (A) - coeficientul pogloscheniya- a (,) - secțiunea transversală efectivă a particulelor absorbante (cm2) - N - concentrație (cm-3). Se presupune că intensitatea luminii incidente este foarte mic. Pentru coeficienții de absorbție mici, atunci când exp (-az) «l-ar, ușor de găsit
(5.3)
In spectrofotometre non laser utilizate surse de lumină de bandă largă, și restructurarea lungimea de undă este realizată folosind prisme sau grilaje de difracție. Pentru liniile de absorbție înguste ale sensibilității depinde nu numai de capacitatea dispozitivului de a înregistra mici modificări în A / în fundalul unui semnal semnificativ din trecut, dar, de asemenea, cu privire la rezoluția instrumentului. De obicei, sensibilitatea maximă este atinsă atunci când A ///>10-4- 10-5.
Utilizarea de lasere permite: 1) îmbunătățește semnificativ rezoluția spectrală a metodei, pentru a determina forma și structura liniilor de absorbție moleculesÐ 2) pentru liniile de absorbție înguste măresc sensibilitatea mai multor 3) simplificarea și reducerea costurilor de configurare experimentale, în unele cazuri, deoarece monocromator la cald (de obicei, constituind cea mai mare o parte voluminoasă și costisitoare a instalației), în prezența laserului nu este necesară (trebuie amintit faptul că unele dintre lasere acordabile sunt, de asemenea, complexe punct de vedere tehnic și costisitoare în troystva) - 4) datorită înaltă densitate lasere spectrale influență mai mică fotodetector zgomot (laser in sine din cauza instabilității puterii de ieșire și frecvența poate introduce erori în rezultatele măsurătorii, astfel încât necesitatea de a controla sau stabiliza parametrii laser care pur și simplu realizate în practică) - 5) datorită unei directivitate ridicată și coerență spațială a luminii laser pentru a efectua măsurătorile urmelor de distanță și de absorbție. În cazul măsurării absorbției slabe în gaze și lichide pot fi utilizate cu celule multitrecere, cuprinzând până la 30-100 pasajelor [P. 42], și sticlă tubulare sau cuarț lungime de fibră optică de 150 m [P. 43].
Avantajele surselor de lumină laser sunt deosebit de evidente în spectrul IR, la studiile de linii de rotație individuale ale benzilor de vibrație, care nu sunt rezolvate prin instrumente spectrale convenționale.
Astfel, sensibilitatea de prag a metodei este determinată de capacitatea de absorbție a aparatului de înregistrare pentru a determina valoarea cea mai mică raportul A / min / 7. Sensibilitatea metodei poate fi caracterizată prin diferite moduri [P. 42]. Sensibilitatea prag a densității optice

sau coeficientul de absorbție

unde - lungimea probei. De obicei sistemul de înregistrare cu ajutorul laserelor furnizează valoarea A / min // = 10-5.
Numărul minim de detectabil pe calea razei fasciculului laser w molecule

concentrare
și molecule de impurități minime de concentrație detectabile
pentru o>= 0,6 cm, c = 10-17 cm2 / = 10 cm, N0 = 1018 cm-3 (numărul total de molecule) și A / S1G // = 1-6 au Afmln «1012- Nmin« 10U cm 3>`« Min «cm-® 10-1- Cmin« 10-7 (100 ppb) [P. 42]. Această caracteristică urme ale unei substanțe în alta: rrsh (mn-1, ppm, g / g) - ppb (ppb 1 ppb, ng / g) - ppt (trilioane 1 părți per trilion, m / g).
Aplicații cuvele MULTIPASS și modulație diferențială a tehnicilor de măsurare a semnalului util poate crește în mod semnificativ sensibilitatea metodei. Dacă modularea amplitudinii intensității radiației sondare și modularea de absorbție poate fi implementată pentru orice surse de lumină, trecerea repetată a mediului (de 100 de ori) și modularea frecvenței luminii sondei poate fi obținută numai atunci când se utilizează lasere. Astfel record pentru spectroscopie IR a fost implementat pentru a laserelor injecție prag de sensibilitate AMLN »3-10-10 cm-1. Pentru spectrometre cu laser, din cauza fasciculului de înaltă coerență sunt puternice efecte de interferență factor de interferență în dispozitivele cu circuite optice. Acest lucru se realizează în principal și valori definite ayu1p [P. 42].
crește în mod semnificativ sensibilitatea metodei (uneori 102- 10B) pot fi folosind absorbția intracavity când celula cu substanța de testat este plasat în interiorul cavității [P. 42, P. 43, 1,12]. Această creștere are loc din trei motive principale. În primul rând, puse în aplicare în mod automat de către un număr mare de treceri (până la câteva sute, dacă nu chiar obiectul de monitorizare introduce pierderi semnificative). În al doilea rând, datorită caracteristicii puterii de ieșire a laserelor prin eliminarea pierderilor din metoda principală de absorbție cauza sensibilitate scăzută rezonator, din moment ce nu se măsoară de fapt, raportul A ///, iar valoarea lui A /. Și în al treilea rând lasere val, în modurile de undă cuplate generatoare (cu laser multimod cu două oglinzi sau un laser cu inel) efectele concurenței asociate crește în mod semnificativ sensibilitatea la schimbările în pierdere în interiorul rezonator.
Intracavity metodă promițătoare pentru detectarea liniilor de absorbție foarte slabe de poluanți atmosferici, produse chimice (de scurtă durată reacții biochimice) radicali și molecule instabile. Pentru a crea un spectrometre extrem de sensibile de principiu de măsurare a absorbției intracavity, lasere acordabile mai potrivite cu linii largi și un loc de trecere mare la. În vizibil - este în impulsuri laser cu colorant in infrarosu - laserele centri colorați.
Principalele aplicații în biologie și medicină. Analiza de absorbție-transmisie este destul de versatil si poate fi folosit cu succes în studiul de gaze, lichide și solide. medii de cercetare în diferite stări de agregare este subiectul diagnosticare biomedicale. O analiză a gazelor, de exemplu, necesită determinarea componentelor gazoase activității vitale a organismelor vii, determinarea concentrațiilor urme de contaminanți (probleme de igienizare și patologie) și așa mai departe.
Pentru controlul poluării atmosferice cu laser sunt numeroase instrumente dezvoltate, dintre care multe se bazează pe măsurători de absorbție [P. 40, P. 42]. Monitorizarea se realizează prin eșantionarea cu absorbție ulterioară în cuvele de analiză multi-pass presiune redusă. Măsurarea absorbanței urmelor contaminanți transportate cu sursa de lumină spațiate și fotodetector, reflector oglinda de la distanță sau lentilă naturală, folosind tehnici de măsurare diferențială. Se aplică, de asemenea, măsurarea heterodyne.
De obicei contaminanți au linii caracteristice de absorbție în domeniul infraroșu al spectrului, astfel încât cele mai frecvent utilizate spectrometre laser bazate injectie si CO moleculara si lasere C02, oferind rearanjarea necesară în intervalul 2,5-46,2 mm.
Cu injecție detectare prag cu laser de poluanți atmosferici, cum ar fi SO2, N20, NH3, și N02, este în intervalul de la 1 la 10 RRB ppt și pentru HCl - 0,1 ppm, HF - 0,5 rrsh. Este posibil să se determine conținutul de acid cianhidric, H20, CH4, S2Nv în fumul de țigară, și conținutul de toxice
impuritățile din gazele de eșapament ale vehiculelor, cum ar fi benzen, la un nivel de 1 ppm [P. 42]. Pentru laser, cu măsurarea frecvenței C02 reglaj discret la metoda de absorbție diferențială de presiune atmosferică (atmosferă de detecție la două lungimi de undă) produc pragul de detecție tipic de ordinul a moleculelor organice poluante 2,5-10-7-5,5 * 10-5% încă un kilometru [ AP 40].
obiecte biologice pentru cea mai mare parte reprezintă un mediu condensat - lichid sau solide. Liniile de absorbție a lărgit considerabil astfel de medii, cu toate acestea, nu este necesar un grad ridicat de monochromaticity a radiației laser, în principiu. Cu toate acestea, lasere și în aceste cazuri sunt foarte utile. În primul rând, o linie îngustă de radiație permite să construiască din centrul mediilor de linie de absorbție cu densitate optică ridicată, furnizând astfel o dependență liniară asupra absorbției de concentrare. În al doilea rând, luminozitatea spectrală ridicată a laserului permite măsurarea absorbției în probe de vedere optic dens. De exemplu, pentru lasere de injectare Dmax = (a /) max «12 [P. 42].
Mediul biologic - este un suport optic neomogen, astfel încât acestea tind să împrăștie lumină puternic. Acest fapt complică foarte mult sau chiar face imposibilă măsurarea spectrului de transmisie, face necesară pentru a comuta la alte metode de măsurare a spectrelor de absorbție. În prezența coeficientului de împrăștiere a (X) (5.1) (5.2) are semnificația deja definit coeficientul de atenuare și de concentrare nu numai chiuvete, ci și lentile în fasciculul laser. Expresiile (5.1) și (5.2) își păstrează forma, ci a = a0. secțiune efectivă atenuare include atât absorbția și împrăștierea:

Pentru o particulă sferică de rază

coeficienții Qn și QP sunt, în general, determinate pe baza teoriei Mie. Valoarea maximă a acestor coeficienți se realizează și la 1-5 [P. 40]. În prezența multor componente, care absorb și împrăștierea luminii, care este de asemenea Biosystems caracteristice (5.2) are forma
unde a0 = stpg + ogrg, Nt - particulă componentă concentrație t-ro.
Evident că, în astfel de condiții în absorbția metodelor spectrofotometrice nu pot fi definite fără implicarea caracteristicilor de împrăștiere. Pentru medii relativ transparente folosind tehnici combinate, care se bazează pe măsurarea spectrelor difuze Spectrele de reflexie și transmiterea obiectelor biologice. De exemplu, în studiile parametrilor de sânge (definind procentul de oxigen din sânge integral, concentrația totală (total) de hemoglobină concentrație sanguină metagemoglobinov) este de mare interes în metoda folosind măsurarea Rn de reflexie difuză și transmiterea relativă a straturilor de sânge de două grosimi T12 [2, 3] . În acest caz, coeficientul de absorbție al unității grosime


unde / și 2 / x - grosime sloev- y a două - parametru determinat de coeficientul de reflexie măsurat
Laserele sunt folosite destul de succes pentru diagnosticarea diferitelor boli, deși nu este tehnici cu laser au câștigat popularitate din cauza. In [P. 39] este o scurtă trecere în revistă a metodelor de diagnostic medical, ca material principal pentru brevete străine, multe dintre care folosesc măsurători de absorbție sau metode combinate. De exemplu, se propune un mod simplu si rapid pentru a numarului de celule roșii din sânge și plachete bazate pe măsurarea intensității luminii transmise și împrăștiată la lungimi de undă de absorbție puternică a celulelor roșii din sânge (415 sau 540 nm). Particulele de sânge trec una câte una prin zona luminata de lumina. Sursele de lumină pot fi luate sau un laser cu colorant sau cu laser Ar cu Si = 413,1 nm. Promițătoare în acest scop, și He - Ne laser, = 543,3 nm.
Este posibil să se pună în aplicare o clasificare și numărare a dimensiunii particulelor de sânge și viabilitatea lor la măsurătorile intensității radiației nu absorbită de particula - laserul Ne, = 632,8 nm. Folosind acest laser poate determina, de asemenea, concentrația de trombocite viabile într-o probă de sânge pentru transfuzie. Privire de ansamblu asupra metodelor optice și dispozitive de numărare a particulelor, inclusiv cele de origine biologică, suspendată
în medii lichide este dată în [P. 48]. Metodele bazate pe absorbția și împrăștierea luminii și umbre și difracție.
Conținutul de oxigen, dioxid de carbon, monoxid de carbon și alte substanțe, inclusiv o varietate de produse de metabolism (uree, glucoza, alcool etilic, polipeptide, etc.), dizolvate în sângele uman este cea mai importantă informație asupra proceselor vitale care au loc în organism. Măsurarea gradului de saturare cu oxigen din sânge pe baza modificărilor semnificative în spectrele de absorbție saturate sau oxigenați de sânge.
Din tabelul. 1.1 rezultă că scăderea saturației de oxigen din sange duce la o creștere de aproape trei ori a coeficientului de absorbție în apropierea A = 620 nm. Rezultă o metodă simplă de estimare a conținutului de oxigen din sânge folosind cel mai accesibil He - Ne laserul cu A = 632,8 nm. Cu toate acestea, măsurători precise, cu o precizie de 1-5% poate oferi doar tehnici mai sofisticate [2, 3], folosind măsurarea trecut și difuz lumina reflectată la mai multe lungimi de undă, inclusiv lungimea de undă de isobestic X = 805 nm, pentru care coeficienții de absorbție saturați și oxigenat coincidența sângelui (vezi Tabelul 1.1.).
Avantaje lasere sunt pe deplin dezvăluite în măsurarea concentrației de gaze dizolvate in sange si metabolice produsele direct prin pielea umană [P. 39]. Metoda se bazează pe faptul că monoxidul de carbon, oxigen, dioxid de carbon și diferite substanțe organice este bine absorb în regiunea IR a spectrului unde acordabil CO, C02 și lasere injecție funcționează. De exemplu, în sânge, cu un conținut ridicat de CO, și 02 C02, maximele de absorbție sunt observate la lungimi de undă de 5,13 4,3 și 9 microni. Pentru liniile de absorbție caracteristice glucozei sunt la 2,8-4.8 și 6.1 microni.
Tehnici de măsurare pot fi variate. Se poate masura coeficientul de un strat subțire de trecere țesut în zona dintre degetul mare și arătător al persoanei în atriul și t. D. Sau utilizați placa de reflexie internă totală, prin care transmite lumina (5 reflecții) și care se aplică obiectului testat (piele, limbii și pr.). In studiul organelor interne se poate folosi un cateter de fibră optică. Pentru a determina cantitativ conținutul acestor substanțe în sânge necesită dispozitive de pre-calibrat folosind probe de referință. Precizia determinării depinde în mod esențial de stabilitatea radiației laser. Multe dintre dispozitivele propuse pot fi utilizate în diagnosticul de laborator al probelor de sânge și alte fluide biologice, cum ar fi urina.
Măsurarea coeficienților de reflexie ale țesuturilor în procesul de coagulare este necesară pentru controlul proceselor termochimice în coagularea focar determinarea feedback-ul final. Un astfel de control este, în special, pentru utilizarea în oftalmologie de coagulare fundus țesut 14]. Se găsește, de exemplu, o creștere puternică reflexie de radiație = 441.6 nm din țesuturi Fundus radiație coagulare retiniene unui laser cu argon (514,5 nm).
Special concepute pentru aplicații medicale, biophotometer cu laser pentru a determina reflectate, absorbite și transmise de suprafață putere biotissue și organele interne [P. 28, P. 37]. În combinație cu lasere acordabile (sau un set de lasere de diferite lungimi de undă) dispozitive de tratare a apelor reziduale radiații fibre optice și rezultatele măsurătorilor pe un computer astfel de Fotocolorimetrele ar fi util pentru diagnosticul țesuturilor patologice în multe domenii ale medicinii (de exemplu, stomatologie, oftalmologie, etc.).
In studiul specimenelor biologice optic groase numai parametru informativ este coeficientul de reflexie difuză, care transportă informații privind spectrul de absorbție al substanței. Exemple de astfel de studii sunt metode Express valori bioanalize diferite culturi cerealiere implementate cu succes în dispozitive cu surse de căldură, în care selectarea lungimii de undă se realizează cu ajutorul unui set de filtre de bandă îngustă [5]. Sondarea eșantion (boabe întregi, măcinate (făină de semințe sau făină)) la lungimi de undă caracteristice în intervalul 1,5-2,5 microni, cu calibrare corespunzătoare și tratarea matematică a rezultatelor pe un calculator permite determinarea conținutului de proteine, grăsimi și umiditate.
Calibrarea, care este cea mai consumatoare de timp parte a procedurii, este de a stabili o corelație între spectrul analitului și spectrul de reflexie al întregului și la sol de cereale, urmată de găsirea unui conținut funcțional componentă relație, determinată prin mijloace chimice și din spectrele de reflexie la lungimi de undă selectate. Calibrarea se realizează pe o gamă largă de probe (30-60). Valorile tipice ale coeficienților de corelație la lungimea de undă de operare pentru diferite culturi sunt în intervalul 0,78- 0,99. Testul standard de eroare spectrofotometrică este de obicei 10-25% la 90-98% fiabilitatea. Studii similare în regiunea vizibilă (410-500 nm) fac posibilă determinarea conținutului de carotenoizi din grâu Krupka (eroarea standard de 24%, cu 90% încredere, coeficientul de corelație este de 0,9).
Utilizarea laserelor în cadrul acestei metode, în plus față de creșterea raportului semnal / zgomot, ar trebui să furnizeze o analiză locală ridicată, până la studiul boabelor individuale, chiar și zone individuale mici de cereale integrale, care pot fi utilizate în creșterea la sortarea semințelor.