Baza fizica de spectroscopie Raman - diagnosticare cu laser în biologie și medicină

Spectroscopie Raman cu laser
Dispersia
Acest capitol tratează metodele mikrodiagnostiki bazate pe inelastic (Raman) împrăștierea luminii (Raman) de molecule biologice. Deoarece obiectele biologice, în cele mai multe cazuri, sunt investigate în soluții apoase sau conțin o cantitate mare de apă, tehnicile de spectroscopie Raman au avantaje importante față de alte metode mikrodiagnostiki a căror aplicare la studiul biomoleculelor in mediul natural este dificil datorită absorbției de apă.
Până în prezent, un mare acumulat date experimentale privind spectroscopie Raman molecule biologice, în special proteine ​​și acizi nucleici. Câteva exemple ale acestor studii sunt prezentate în acest capitol.
În plus biomoleculelor și complexele lor obiecte spectroscopie Raman sunt din ce in celule si structura multicelulare vii. Perspective mari se deschid în legătură cu dezvoltarea tehnologiei Raman microscopie.
Pe lângă metodele de spectroscopie Raman spontane, sunt date informații de bază despre relativ noi și cele mai promițătoare tehnici: Raman scattering spectroscopie si spectroscopie Raman active.
baza fizica de spectroscopie Raman și soiurile sale
Raman spontan. Un rezultat al interacțiunii luminii cu obiecte biologice este împrăștiere neelastică, care variază datorită nu numai direcția, ci și frecvența radiației. Fig. 6.1 prezintă exemple de realizare posibile și efecte ale interacțiunii cuantice luminii cu molecula. Aici,

și prima stare excitată electronic notată S0 și, respectiv. Fiecare dintre aceste niveluri de energie cuprinde o multitudine de subnivele vibraționale Y 2, 3 ,. D. Tranzițiile între diferitele niveluri și subnivele indicate prin săgeți, în care săgeata lungime în sus, proporțională cu frecvența luminii incidente.

Fig. 6.1. tranzițiile energetice posibile în moleculă, de fotoni inelastică care interacționează cu lumina
Lungimile săgețile îndreptate în jos proporțională cu frecvența luminii dispersate.
Ca rezultat al interacțiunii într-o ordine de timp al perioadei de fluctuații ușoare, t. E. Aproximativ 10 ~ 15 secunde, molecula se mută într-o stare de energie mai mare. Apoi, la un interval de timp de aproximativ 10&rdquo-11 eliberare poate avea loc cu cuantice a luminii, dar are o frecvență care este o frecvență a unei combinații a luminii incidente și frecvența de tranziție de vibrație. Mai mult decât atât, în cazul în care fotonul eliberat are o frecvență mai mică decât frecvența luminii incidente, și anume v0 - vK0J1 (săgeata se termină la nivelul vibrațional, situate deasupra sursei), se observă o așa-numitele componente de difuzie a luminii Stokes Raman. Dacă există o tranziție de energie la o stare sub nivelul inițial, adică. E. a lansat incidentul foton mai multa energie (v0 + vKOJI) Energia, atunci o astfel de componentă este denumită anti-Stokes Raman. În ambele cazuri, diferența de frecvență între incident și V0- lumina difuză (v0 ± vKOJI) este egală cu frecvența de o vibrație moleculară.
Probabilitatea de apariție spontană Raman substanțial mai mică decât probabilitatea Rayleigh (elastic) imprastiere, intensitatea semnalului, astfel, foarte scăzută. Astfel, în condiții normale intensitatea anti-Stokes împrăștiate componenta de lumină este semnificativ mai mică decât intensitatea componentei Stokes. Intensitatea semnalului depinde de frecvența luminii incidente: departe de domeniul absorbției electronice este vj proporțională, atunci când se apropie banda de absorbție se observă creșterea intensității mai rapidă Raman. După contactul cu v0 frecvență în zona benzilor de absorbție ale substanței există o așa numită scattering rezonanță Raman (RRS).
Intensitatea liniilor RRS poate fi de mai multe ordine de mărime mai mare decât intensitatea unui CD convențional. Datorită acestui fapt, folosind CRR poate detecta selectiv luminii împrăștiate de compușii individuali în sistemele biologice multicomponent. Intensitatea Raman convențională de celelalte componente ale sistemului, astfel, atât de mică încât, practic, nu diferă de fundal.

Deoarece orice biomolecule constă dintr-un număr mare de atomi și grupe atomice, intensitatea luminii incidente,
Fig. 6.2. spectru Raman de apă în stare lichidă produsă după excitarea cu laser Ar (, = 488 nm, h-1 = 20,492 cm&rdquo-1). Abscisa este unități absolute și relative (număr de undă)
care interacționează simultan cu mulți atomi, oferind linii de spectru Raman. Poziția liniilor în spectrul este determinată numai de frecventele principale de oscilație ale statelor electronice (valori vK0JI j). Prin urmare, spectroscopie Raman - această opțiune spectroscopia vibrațională. In mod similar, spectroscopie IR, Raman utilizarea sens spectroscopie in studiul obiectelor biologice este de a lega spectrele Raman ale proprietăților chimice ale acestor obiecte care constituie biomoleculelor și împrejurimile lor imediate, este bine caracterizat prin spectrele vibraționale.
Fig. 6.2 este prezentat ca un simplu exemplu de spectru Raman de apă în stare lichidă - compuși biologici solvenți fiziologici naturali. Spectrul a fost obținut prin radiație de excitație laser Ar apă (A = 488 nm). Axa orizontală reprezintă lungime de undă în nanometri, număr de undă, precum și deplasări în raport cu numărul de undă al radiației excitant corespunzătoare (A, -1 = 20,492 cm-1). Cea mai puternică linie în spectrul <3415 см-1) появляется в результате обмена энергии падающего света с энергией валентных колебательных движений, соответствующих растяжению связи О—Н. Колебания,, происходящие при деформации угла Н—О—Н в молекуле воды, проявляются в КР-спектре существенно слабее (линия 1619 см-1).
O caracteristică importantă a spectrului Raman al apei este că, cu excepția liniei intensității vibrațiilor de întindere a acestui spectru este scăzut. Acest lucru îi permite să obțineți un spectru clar linie de fond Raman a substanțelor dizolvate. Acest spectroscopie Raman este fundamental diferită de spectroscopie în infraroșu, deoarece apa absoarbe foarte mult radiațiile infraroșii.
Compararea intensităților liniei din spectrele Raman obținute de la un număr mare de molecule diferite, a făcut posibilă formularea unor reguli generale [1, P. 8]. De exemplu, vibrațiile de întindere sunt prezentate în spectrele Raman vibrațiilor de deformare mai puternice (am văzut în acest exemplu apă) - linia de legături multiple oscilații ar trebui să fie mai intense decât fluctuațiile de linie liniile svyazey- simple, din cauza variațiilor de obligațiuni de fază de valență, mai intense, decât liniile din cauza oscilații anti-fază ale acestor legături.
De obicei, Raman Spectra contribuției predominante poliatomic Molecule unele grupe de fluctuație de atomi. Acestea sunt de obicei găsite în grupuri molecule organice ca C-H, O-H, N-H, S-H, C = C, C = 0, și alții. Poziția exactă a spectrelor liniilor corespunzătoare în acest grup fluctuații depinde de tipul de legături cu alți atomi. Astfel, în spectrul de molecule având o grupare = C-H, există o linie de 3300 cm-1 grupline corespunde la 2960 cm-1 și 3020 cm-1 gruppeliniya.
Un exemplu al unui grup mai complex de atomi, care acționează ca un oscilator independent în moleculele de polipeptide și proteine ​​este așa-numita amidă

aminoacid format prin legarea la reciproc, diverse tipuri de oscilații ale acestui grup sunt prezentate în spectrele Raman ca așa-numitele amidosulfaților benzi 1, 2-amida-8. Cea mai puternică bandă amidă-amidă și 1-3 situată aproape de wavenumber 1660 cm-1 și 1250 cm-1, respectiv. amidă-2 bandă în spectrele Raman ale proteinelor este slabă. Poziția exactă a maximelor benzilor și contururile lor forma de proteine ​​definite de structură secundară.
În mod similar, vibrațiile grupărilor fosfat

coloana vertebrala a moleculelor ADN și ARN sunt responsabile pentru apariția în CD-spectrele acestor două macromolecule linii caracteristice puternice lângă 800 și 1100 cm-1. Intensitatea și poziția primul dintre ele depinde de conformația structurii secundare și ordine.
Liniile caracteristice sunt disponibile în spectrele Raman și alte macromoleculelor biologice. În plus față de aceste linii caracteristice ale spectrelor Raman ale macromoleculelor și sistemelor biologice conțin un mare număr de alte linii care postscript anumite vibrații intramoleculare constituie unul dintre obiectivele spectroscopie Raman obiectelor biologice.

Fig. 6.3. O diagramă bloc a aparatului pentru înregistrarea spectrelor Raman într-un experiment tipic: 1 - laser 2 - lentila de focalizare, 3 - celula cu proba de testare, 4 - condensator 5 - turbiditatea de intrare 6 - monocromator 7 - fotomultiplicator sau analizor multicanal

Informații generale despre tehnica experimentală. Fig. 6.3 prezintă elementele optice de bază necesare pentru înregistrarea spectrelor Raman spontane a unui experiment tipic. Folosind un laser ca sursă de radiații monocromatice intense în experimente pe excitație și înregistrarea CD-ului a fost condiție necesară pentru dezvoltarea rapidă a acestei metode și punerea sa în aplicare într-o chimie largă și biologie.

Laserele au eliminat majoritatea dificultăților anterior aparent insurmontabile și limitărilor asociate cu site-urile de testare și, după cum sa menționat mai sus, soluțiile lor apoase. Cele mai frecvent utilizate continuu Ar și Kr lasere de tuning discrete lungime de undă, precum și lasere colorantă și oscilatoare parametrice lumină de lungime de undă în mod continuu acordabile. lasere pulsatorii permit puls poluchat` mare a puterii radiației sondă la o putere medie relativ scăzută și, cel mai important, rezoluția temporală ridicată a spectrelor înregistrate.
Register spectru Raman se realizează fie printr-un fotomultiplicator conectat cu un monocromator de scanare (de obicei dublu pentru detuning de încredere de lumină elastică împrăștiate) sau un analizor multicanal optic. Acest analizor este o linie de mai multe sute de fotodetectori de înaltă sensibilitate în miniatură sau o cameră de televiziune. Spectrul spectrometru linie de scanare înregistrat secvențial, cu întregul spectru în intervalul de zeci până la mii de cm, cu rezoluție de până la câțiva centimetri inverse este obținută într-un timp de câteva secunde.
Utilizarea analizorului optic mai multe canale vă permite să conectați toate liniile spectrului de frecvențe, în același timp, care durează mult mai puțin timp pentru a vplot- nano- și picosecunde.
Un obstacol în înregistrarea spectrelor Raman efectuează probe de fond luminiscenta - proces mult mai probabil decât CD-ul (a se vedea capitolul 7 ..). Sursele de luminiscență sunt impurități sau cromofori endogene. Reduce fundal nedorit luminiscență se suprapun linie Raman uneori slab, pentru a realiza curățarea temeinică a eșantionului, selectarea optimă lungimea de undă de excitație de radiație sau adăugarea unei soluții de inactivare speciale substanței de testat. În unele cazuri, este posibil arderea impurităților luminescente prin expunerea prelungită a probei prin radiație laser intens. Această din urmă metodă, cu toate acestea, poate duce la o modificare fotochimice, și chiar distrugerea probei.
Mai promițătoare prin separarea spectrele Raman ale luminescență este de a utiliza un laser Raman pentru excitarea impulsuri picosecunde. Având în vedere că durata de viață a luminescenta chiar rapid (fluorescenta), se află în intervalul nanosecunde (a se vedea. Ch. 7), în contrast cu intervalul picosecundă de pe CD-ul, folosind un sistem de înregistrare de mare viteză se oprește după ce a primit radiatii Raman înainte de a se alătura luminescență ray, poate elimina fundal line a spectrului.
spectroscopie Raman Active (CARS). O metodă fundamental diferită de înregistrarea spectrelor Raman obiectelor cu un nivel ridicat de fluorescență este CARS [2]. Pentru a pune în aplicare această metodă, folosind două cu laser acordabil cu o frecvență Vj și radiații V2. Intersectarea într-o probă, grinzile de radiație ale lasere induce în acesta momentul dipolar, caracterizat prin susceptibilitatea neliniar de ordinul trei. Rezultatul este o imprastiere coerenta anti-Stokes, cu o frecvență VA = 2vx-v2. Direcția de propagare a semnalului este determinat prin efectuarea potrivirii fază a vectorilor de undă ale undelor care interacționează diferă de direcția de propagare a radiației pompei. Intensitatea acestei disparați lumina crește în mod semnificativ în cazul în care diferența de frecvență vx-v2 coincide cu frecvența vibrațiilor investigate intramoleculare. Varierea vx-vs prin reglarea frecvenței laser poate prescrie spectre Raman într-o gamă largă și, astfel, a construi în mod eficient a fluorescenței în regiunea mai scurt anti-Stokes.
Un alt avantaj este abilitatea de a permite ARS liniilor spectrale la distanțe apropiate și suprapuse asociate cu faptul că rezoluția spectrală nu este CARS spectrometru monocromator este determinată, iar lățimea liniilor de lasere utilizate [2].
Obținerea spectrelor CARS calitative previne prezența semnalelor optice neliniare non-rezonante datorită contribuției moleculelor de solvent. Inhibarea fiind realizată prin intermediul elementelor de polarizare utilizând diferite caracteristici de polarizare Contribuții rezonante și nerezonanți [3, 4].
Îmbunătățită Raman (SERS). In ultimii ani, biologie moleculara si biochimie au început să folosească un alt tip de spectroscopie vibrationala, bazată pe fenomenul SERS ușoare [5-7]. Esența acestui fenomen constă în marile (până 105-10e timpii) creste Raman molecule secțiune transversală adsorbite pe suprafața metalică. Ca rezultat, spectrele SERS nu au putut să se înregistreze la concentrații mai multe ordine de mărime mai mici decât în ​​spectroscopia Raman conventionale.
In SERS fenomene bazate pe două mecanisme: un solenoid asociat cu creșterea câmpului electromagnetic local, în apropierea suprafeței și moleculare asociate cu formarea de stări excitate ale complecșilor metalici ai moleculelor [8]. SERS intensă se observă suprafețe metalice mai des pregătite special cu o rugozitate puternică. Spectrele SERS ale moleculelor biologice au tendinta de a intra in celule electrochimice, în hydrosols metalelor și filme metalice cu neomogenitati regulate. Pentru înregistrarea spectrelor utilizând același echipament ca și pentru spectrele Raman conventionale. Pentru a aplica nici o radiație laser de excitație în domeniul vizibil, care depășește în mod obișnuit capacitatea mai multor zeci de milliwatts.