Microscopia si microspectrofluorometers - cu laser diagnostic în biologie și medicină

Video: Microscopia electronică de obiecte biologice © Electron Microscopy de obiecte biologice

7.2. microscopie de fluorescenta cu laser
și microspectrofluorometers
Informații generale. Utilizarea de lasere și metode de prelucrare a informațiilor digitale promovate în mod semnificativ Microfluorometric capacitățile de diagnosticare. Pe de o parte, lasere oferă o densitate mai mare putere spectrală a radiației de excitație, care este o pierdere scăzută poate fi concentrat la un diametru loc de aproximativ un micrometru. Pe de altă parte, utilizarea, împreună cu alte dispozitive asociate cu calculatorul contemporan detectoarele video de înregistrare intensitate ultra realizează supersensibile înregistrare distribuția spațială a fluorofori în celule, membrane și alte sarcini eficient, legate de măsurarea unor cantități mici de analiți într-o varietate de medii de modelare și structuri biologice.
Analiza cantitativă mikrospektrofluorimetrichesky molecule biologic active. Schema este destul de simplu laser microscop cu fluorescență, care a fost construit pe baza unui microscop cu fluorescență „LUMAM-OF“ este prezentată în Fig. 7.2 [9]. Pentru excitarea fluorescenței cu ajutorul unui laser continuu nu-Cd (Rx = 441.6 nm, >z = 325 nm).

Fig. 7.2. Schema pulsat microscop cu fluorescență: 1 - laser 2 - modulator 3> 10 - PMT 4 - telescop 5 - câmp diafragma 6 - oglinda selectiv 7 - lentile, 8 - obiectul în studiu, 9 - filtru, 10 - amplificator-discriminatoare
11 - unitate pentru interfațare cu un calculator, 12 - COMPUTER "Spark-226" 14 - duză monocular [9]
detecție fluorescentă este realizată cu ajutorul unui tub fotomultiplicator (PMT) în modul de numărare foton la nivel de un electron, cu scăderea automată a mediului ambiant de fond și PMT zgomot intern. Gama de lungimi de unda - la 360 - 800 nm, intervalul dinamic al fluxului luminos măsurat - 10s, eroarea de măsurare înregistrată a fluxului de minimum 10%, diametrul fasciculului de radiație excitație într-o regiune de detecție de 1 - 100 microni.
Microfluorimeter utilizat pentru analiza aminoacizilor cantitativ pentru determinarea conținutului de ADN în celulele bacteriene. În particular, petele de scanare cromatografice obținute în separarea derivaților de aminoacizi BPS-CSN-Phe, CSN și CSN-Gly-Jle pe plăci acoperite cu poliakridnym gestionate registru fiabil cantitatea de substanță în loc cromatografice 10/05/14 mol. Acest 1.5 ordine de magnitudine mai bine realizat în prezent rezultatele de detecție cantitativă a derivaților de aminoacizi, separate prin cromatografie în strat subțire, fluorescența obținută excitat de o lampă cu xenon.
Una dintre problemele majore ale biologiei celulare moderne este de a determina concentrația ionilor de calciu liberi, [Ca2 *] în interiorul celulelor vii. Acest obiect a fost rezolvat cu succes printr-un microfluorimetry cu laser folosind sonde fluorescente. De exemplu, ia în considerare metoda de măsurare [Ca2 +] in celulele musculare izolate [10]. Ca probă a fost utilizat colorantul indo-1, cu un maxim de absorbție într-un complex cu Ca2 + la 331 nm, maxim fluorescenței la 398 nm și fluorescență eficiența cuantică a 0,56. Fluorescența a fost excitat cu laser radiatii nu-Cd (X = 325 nm) cu o putere a fasciculului probă este mai mică de 1 mW.
Procedura de măsurare constă în determinarea raportului intensităților fluorescenței la două lungimi de undă = 422 și X2 = 468 nm: /?=/(H1)//(A.2) și calcul suplimentar, dar formula [Ca2 +] = S6D (Rmin-R) / (R-Rmax), unde Rmin și Rmax - R valorile ET0 la zero și satureze Ca2 +, respectiv, 0,972- C = constantă de proporționalitate &d = 250 nmol / l - constanta de disociere. Valori RMM, #max și R au fost determinate pe o soluție calibrat colorant 6 umol.
Folosind o astfel de instalație prima dată posibilă determinarea valorilor caracteristice ale [Ca2 +] în intervalul de 100 - 300 de nmol / l in celulele vii, cu o precizie de ± 10 nmol / L, cu o rezoluție spațială de 2 microni, în mai puțin de 0,5 secunde.
Una din aplicațiile practice ale microspectrofluorometers cu laser este identificarea și studierea proprietăților pigmenților și a coloranților în celulele vii. Exemple de astfel de lucrări sunt experimente pentru a studia fotopovedeniya alge unicelulare, care prin această metodă au fost determinate organelle, servind ca fotoreceptoare și molecula photopigment [P. 7].
Un alt exemplu - înregistrarea în celulele de spectre de fluorescență fotosensibilizant tip colorant hematoporfirină, utilizarea pe scară largă în medicină, care începe în legătură cu dezvoltarea unor metode eficiente de diagnostic și tratament cu laser a tumorilor maligne de viață. Mai în detaliu, acest exemplu va fi discutat în 7.3. Joi]
O trăsătură comună a acestor lucrări este utilizarea de lasere acordabile și cu impulsuri și o măsurătoare cinetică cu o rezoluție temporală ridicată.
bază instrumentală microscopie cu fluorescență modernă, cu excepția lasere și PMT în modul de numărare foton include detectoare video, care funcționează la niveluri foarte scăzute de intensitate de fluorescență cadre video incluse în eșantion, introducerea lor ulterioară în calculator și prelucrarea digitală. Videomikrofluorimetry au o serie de caracteristici care sunt importante pentru cercetarea biomedicală: prelucrarea informațiilor rapide, detectarea extrem de sensibile, formatare digitală și analiză a datelor, conservarea și acumularea de informații despre relațiile spațiale. Aceste caracteristici permit înregistrarea distribuții spațiale și temporale ale componentelor fluorescente în obiectul supus încercării cu viteză și precizie anterior irealizabil prin alte metode. stocare video, disc magnetic nu oferă doar 100% fiabilitatea reutilizarea, dar, de asemenea, permite cercetătorului să se refere în mod repetat, pentru a le în scopul prelucrării matematice a diferitelor algoritmi.
Analiza microfluor transportului intracelular. Reprezentarea digitală a imaginilor obiectului fluorescent este deosebit de important în studiul distribuției moleculelor asupra membranelor celulare, traficul intracelular particule compartimentarea sonde specifice din interiorul celulei și motilitatea celulară.
De exemplu, în prezent în curs de desfășurare pentru a studia interacțiunea dintre hormoni și factori de creștere pentru receptorii celulari membrana si internalizare ulterioare. Unul dintre obiectivele acestei lucrări este de a clarifica mecanismele de tulburări de reglare a creșterii în celulele canceroase. Cele mai multe ligand macromolecular se leagă la celula în timpul endocitoza prin intermediul receptorilor. ligand Complexele - receptor de membrană învelită totală formată din secțiuni individuale ale membranei plasmatice a celulei. Cele formate vezicule închise sunt transportate în celule de adrese specifice, cum ar fi nucleul. Acest tip de transport în celulele vii și pot fi vizualizate cu ajutorul anticorpilor fluorescenți atașate la vezicule. Proceduri de calculare a mediei digitale permit imagini pentru a studia natura mișcării de vezicule închise la niveluri de excitație scăzute care vizual în vezicule fluorescente microscop doar nediferențiabile de fundal.
Ca o altă problemă importantă poate fi menționată măsurarea membranei de difuzie de translație în plan și într-un obiect relativ subțire tridimensional. Această problemă este rezolvată cu ajutorul unor tehnici de fotooxidare. Baza acestor metode este fotooxidare zonelor locale ale obiectului testat purtând molecule fluorescente, în scopul de a modifica fluorescența și măsurarea cineticii recuperării fluorescenței datorită difuze fluoroforilor nondiscolored afluxul de mediu în regiunea iluminată de fasciculul laser. Această zonă poate lua forma de pete, dungi sau altă formă.
Cinetica recuperării fluorescenței asociată cu difuzie sau debit raportul de molecule marcate [II]. De exemplu, în cazul recuperării bidimensional fluorescență în difuzie restricționată difuzivitatea obiect este direct proporțională cu pătratul razei spotului cu laser în planul obiect, și invers proporțională cu recuperarea fluorescenței timp până la jumătate din nivelul inițial. Nivelul final la care fluorescența restaurată, asociată cu fracția mobilă de molecule marcate.
In prezent, nici o altă metodă nu furnizează informații comparabile despre mobilitatea translatie a moleculelor în anumite zone ale membranelor celulelor individuale sau organite celulare. Principalele etape ale experimentului sunt:
înregistrarea fluorescență din zona selectată anterior a membranei, sau suprafața dimensiunii subțire obiectului filmului de mai multe mikrometrov-
puls iradiere cu laser fascicul acest domeniu (de obicei, nu-Cd sau Ag), epuizeaza rapid o mare parte din timpul fluoroforilor 5-50 microsecunde, astfel încât intensitatea fluorescenței acestei zone dramatic padaet-
măsurarea cinetica recuperării fluorescenței, încă de la sfârșitul impulsului de albire, care este ghidat pe regiunea investigată putere „măsurare“ Raza laser scăzută (de obicei 103-105 ori mai slab), fluorescență interesantă în același mod ca și în prima etapă.
În efectuarea de astfel de înregistrare experimente de fluorescență poate fi realizată cu un fotomultiplicator. Cu toate acestea, utilizarea de sisteme video poate oferi o oportunitate de a studia procesul de recuperare a detaliilor spațiale care permite, în principiu, valorile count locale ale coeficienților de difuzie sau debitele în zona de studiu, cum ar fi în interiorul celulei.
măsurarea cineticii de recuperare a fluorescenței după metoda utilizată pentru a studia agregarea macromoleculelor și a proceselor de auto-asamblarea organitelor celulare fotooxidare. De exemplu, prin această metodă au fost studiate direcție și un mecanism de polimerizare microtubulilor. Așa cum sa folosit fluoresceina fluoroforului. Măsurătorile permit excluderea ipotezei conform căreia monomerii includ tubulinei în microtubuli în partea de mijloc și a pierdut la porțiunea de capăt a lui x.
Am investigat cinetica polimerizarea actinei globular în soluție apoasă, în prezența sării sau cationi bivalenți KC1 Ca2 + și Mg2 +. In procesul de polimerizare sunt formate lungi (10 - 100 microni) F- filamente de actină. A fost mai întâi demonstrat că fracțiunea actin nepolimerizată rămasă în prezența filamentelor în creștere este o formă monomerică a G-actină.
Această tehnică vă permite să urmărească cu precizie influența diferiților reactivi în procesul de auto-asamblare. De exemplu, adăugarea rezultatelor cytochalasin B într-o scurtare a filamentelor și adăugarea unei soluții aldolazy - o proteina care se leaga de filamente de actină, - crește slab fracțiunea mobilă actinei. Cel mai probabil, acest lucru se datorează formării legăturilor încrucișate între catene aldolaznyh F-actina.
Cele mai interesante sunt experimentele cu amibe vii. Microinjecția în celulă au fost injectate cu proteine ​​marcate cu fluoresceină: G-actina, albumină serică bovină (BSA), ovalbumina și ribonucleaza A. Valorile măsurate ale difuziei moleculelor de proteină din celulă au fost în 2-3 ori raporturi mai mici decât în ​​apă. Mai mult, sa constatat că moleculele de G-actină, deși greutatea lor moleculară este cu 50% mai mică decât cea a moleculelor BSA difuza mai lent decât molecula BSA. Aceasta confirmă ipoteza a prezentat anterior că celula G-actina este complexat cu alte molecule de tip considerabil dimensiune profilin.
In plus, cinetica recuperării fluorescență după albire observație a arătat că o fracțiune fixă ​​de F-actina este, în medie, aproximativ 10% din totalul actinei în celulă. În diferite părți ale raportului de celule este diferită: în coada - mai mult, mai mult parte cap mobil - mai puțin. In domeniul membranei plasmatice conține până la 50-80% filamente inactive. Acestea și alte studii (de exemplu, auto-asamblare microtubulilor), arată că metoda de fotooxidare este foarte eficace nu numai în măsurarea mobilității membranei, dar, de asemenea, în studiul transportului macromoleculelor în soluție și în matricea intracelulare.

Video: Microscop medical XS-90