Spectroscopie laser de împrăștiere cvasi-elastic - diagnosticare cu laser in biologie si medicina

spectroscopie laser de împrăștiere cvasi-elastic
Acest capitol discută despre posibilitatea de a utiliza dispersia luminii laser pentru a studia caracteristicile dinamice ale micro-obiectelor biologice: coeficientul de difuzie, direcția vitezei de transport și mișcările migratoare, parametrii și mobilitatea intramoleculară intracelular. Din aceste caracteristici măsurate pot fi de așteptat dimensiunea, greutatea și alte caracteristici ale unui număr de lentile. Aceasta este zona de așa-numita dispersia luminii cvasi-elastică, în care nu există nici o schimbare semnificativă în lungimea de undă a radiației de sondare în contrast cu împrăștierea Raman, care vor fi discutate în Sec. 6.

3.1. Baza fizică a metodei. Principalele tipuri de spectrometre

Bazele fizice. Lăsați mediul conținând particulele de împrăștiere în mișcare, cade lumina polarizată liniar monocromatică a undei sondă cu vectorul de undă E3 D3 (Fig. 3.1). La fel ca și în experimentul pe dispersia luminii elastice, valul împrăștiată este înregistrat la punctul de la distanță, la unghiul 0. Acesta este caracterizat printr-un vector gv val. Dacă vom neglija posibilitatea împrăștierii multiple și interacțiunea particulelor cu altele, lumina împrăștiată poate fi reprezentat ca o sumă de contribuții de la N particule imprastiere independente simultan:

în care Ep0j - amplitudinea undei luminii împrăștiate de particula / th cu un dependent de timp de coordonate r, (0, F- - faza / val -lea împrăștiate, este determinată prin diferențială de împrăștiere wavevector q = qv-q3 cum ar fi Oj = qrj (t ).
După cum sa menționat deja, 2-IRN = / k cu împrăștiere cvasi-elastic. În consecință, pur din punct de vedere geometric
Fig. 3.1. Geometria cvasi-elastice experiment de împrăștiere a luminii
Fig. 3.1 pot fi obținute pentru modulul expresiei vectorului de undă scattering
(3.1)
Trebuie remarcat faptul că, în plus față de coordonatele centrului de masă al particulei poate depinde de timpul și amplitudinea Ep0j, de exemplu, o schimbare în procesul de măsurare a proprietăților de împrăștiere, configurația sau conformația particulelor în timpul mișcării de rotație a particulelor nesferice, iar în alte cazuri. Ca rezultat, unda împrăștiate obținem expresia
(3.2)
Acest lucru arată că, prin înregistrarea unei schimbări temporare (trend) a amplitudinea și faza (frecvența) a radiației împrăștiate, este posibil, în principiu, pentru a obține o mulțime de informații despre parametrii dispersori dinamice. Subliniem încă o dată că împrăștierea cvasi-elastică este determinată printr-un relativ lente procese dinamice, cu timpi caracteristice în intervalul de 10&ldquo - * - 1 s, care este semnificativ mai mare decât timpul caracteristic vibrațiilor intramoleculare rapide, care determină interacțiunea radiației inelastice cu Biomacromolecules (a se vedea capitolul 6 ..).
Schimbări temporale împrăștiate quasielastically parametrii de radiații se manifestă într-o schimbare a funcțiilor sale de corelare sau, echivalent, pentru a modifica spectrul său de frecvență. În funcție de natura mișcării lentilelor sau a spectrului optic largeste numai sau are vârfuri suplimentare apar la frecvențele decalate. Cu toate acestea, aceste schimburi și lărgime constitutivă în funcție de obiectul de testare, în mod tipic de la 10 Hz la 10 MHz, sunt atât de mici în comparație cu frecvențele din domeniul optic (circa 5-1014 Hz) care înregistrează metodele tradiționale de spectroscopie optică, nu este posibil - chiar și cele mai bune spectrometre optice cu Fabry - Perot nu se poate distinge în componenta spectrului optic situat mai aproape de 10 MHz. În consecință, pentru sarcinile care aveți nevoie pentru a efectua analiza spectrală a rezoluției ultra-înaltă.
Acest lucru a devenit posibil după dezvoltarea în 60-e ale tehnicii de amestecare optice (OS), a intrat în practică larg numai odată cu apariția de lasere. Esența acestei metode constă în aceea că atunci când se amestecă pe un fotodetector pătratice (fotodiodă, fotomultiplicator) undele luminoase de frecvențe diferite la ieșirea fotodetector este format dintr-un semnal electric, frecvențele de diferență modulate. Din moment ce, în cazul nostru, aceste frecvențe sunt apropiate, semnalul de bataie are un caracter, al cărui spectru este asociat în mod unic cu un spectru de lumină difuză. În acest caz, așa cum sa menționat deja, este situat în intervalul de frecvență joasă și pot fi supuse unei analize mai optice și prin mijloace de radio, oferind rezoluție spectrală amplă (până la o fracțiune de hertzi). Teoria și metode practice de implementare a sistemului de operare, atunci când înregistrarea prin difuziunea luminii quasielastic sunt descrise în multe cărți și comentarii (a se vedea., De exemplu, [1-15]).
Tipuri de sisteme de operare de spectrometre. Luați în considerare principiile cele două varietăți principale ale acestor spectrometre. Spectrometre Monodinnye (MS), uneori, de asemenea, numite homodină operează pe o alocare de frecvență samobieny diferite componente spectrale ale luminii dispersate. Schema MS prezentat în Fig. 3.2. MS este furnizat la un fotodetector particule numai împrăștiate câmp cercetat Ep. Fotodetector așa cum sa menționat mai sus, se înregistrează nici o tensiune, iar pătratul intensității câmpului. Prin urmare, curentul de ieșire este proporțională cu magnitudinea 1fp | p | 2. Factorul de proporționalitate depinde de eficiența cuantică și receptor proprietățile coerente ale luminii dispersate. Este la orice lumină, detectabil de către receptor, era coerent, adică. E. Toate valurile împrăștiate de obiect de testare particule diferite, cad pe suprafața receptorului fotosensibile în fază, unghiul solid
colectare 0 spectrometre de radiații împrăștiate în sistemul de operare este de obicei limitată de diafragme. În cazul în care unghiul de coerență MS, care este evaluată prin expresiaunde I - mărimea caracteristică a câmpului sondat [9].
Efectuarea funcționarea cvadratura expresiilor (3.2) și calcularea spectrului de putere al fotocurentului, se poate demonstra

Fig. 3.2. Schema cu laser MS: cu laser 1, 2- un aparat de procesare a semnalului, 3 - limfragmy, 4 - lentila 5 - fotodetector
că acest spectru este format din trei componente: o componentă constantă și fluctuații ale spectrului de zgomot împușcat detectat intensitatea câmpului doar transportă informații utile. Rețineți, totuși, că în spectrul MS al distorsiunii optice în spectrul fotocurentului se repetă numai în cazul statisticilor gaussiene câmp împrăștiate. De obicei, este realizată atunci când numărul de particule care contribuie simultan difuzează la câmpul măsurat, N ^> 1.
Principalul spectrometru diferență heterodine (WAN) amestecarea optică din MS este că o altă persoană decât radiația împrăștiată prin referința obiectului studiat furnizat (heterodină) unda EG cu o frecvență fixă ​​fotodetector. Intensitatea acestui val ar trebui să pb de multe ori mai mare decât intensitatea câmpului imprastiate. Ca referință, utilizat în mod normal o parte din radiația emisă de același laser, care excită imprastiere. Acesta poate fi alimentat într-un fotodetector sau prin utilizarea unui sistem de oglinzi, așa cum se arată în Fig. 3.3, sau poate fi luminii împrăștiate de dispersori imobile situate în apropierea volumului de măsurare, de exemplu, pe pereții celulei. În unele cazuri, al doilea laser poate fi utilizat pentru obținerea radiației de referință, sincronizat cu primul.
amestecare optică eficientă a undelor împrăștiate și fotodetector de referință în construcția are loc numai la coordonarea lor fronturi de undă. Acest lucru înseamnă că geometria locului de instalare a elementelor care definesc unghiurile de incidență și de colectare pe un detector de lumină difuză și un val de referință trebuie să fie astfel încât aceste valuri sunt coerente. Acest lucru creează unele dificultăți în înființarea SA. Cu toate acestea, dificultățile de plată de pe avantajele WAN în comparație cu statele membre, care, în unele cazuri, sunt de o importanță fundamentală.
Unul dintre beneficiile care decurg din faptul că, în starea | g | ^>| p | și amestecarea de înaltă eficiență a acestor valuri

Fig. 3.3. Conducerea GS cu laser: simboluri sunt aceleași ca și în Fig. 3.2
6 - oglinzi
Utile componenta semnalului g`fP este proporțională cu intensitatea fasciculului de referință. Această situație face posibilă obținerea câștigului în valoarea semnalului dorit.
Fundamental important este, de asemenea, faptul că componenta informativa grea a spectrului de putere al fotocurentului, incluzând și o componentă de zgomot constant și, spectrul optic independent reproduce statisticile câmpului imprastiate. Mai mult, spre deosebire de construcție în SM nu numai sensibile la mișcările de tip lentilă fluctuație difuzie echilibru dispersabile și migrația aleatorie, ci și pe direcția de deplasare. Această caracteristică a construcției dezvăluie relația lor strânsă cu anemometre cu laser dopleroskim (LDA) - dispozitive concepute special pentru măsurarea debitelor de lichide și gaze [13, 14].
După cum rezultă deja din titlu, principiul de funcționare a acestor dispozitive se bazează pe înregistrarea schimbă frecvența radiației împrăștiate de particule în mișcare. Apariția acestor schimbări în lumină difuză, în cel mai simplu caz, atunci când dispersori se deplaseze în aceeași direcție cu viteză constantă, văzută din analiza expresiei (3.2). Într-adevăr, dacă rj (t) = r0j (t) + v0jt,

e. faza a valurilor împrăștiate se schimbă liniar în timp. Deoarece frecvența undelor este derivata fazei, atunci acest lucru înseamnă că, în acest caz, lumina împrăștiată devine schimburi de frecvență constantă
(3.3)
având originea Doppler. aici <р — угол между направлениями векторов q и V. Все множество доплеровских сдвигов частоты, содержащихся в рассеянном свете, называется доплеровским спектром. Обращает на себя

Fig. 3.4. Conducerea diferential LDA: simboluri sunt aceleași ca și în Fig. 3.2 și 3.3
cont dependența liniară a vitezelor Doppler ale particulelor de imprastiere.
Ca un exemplu luat dintr-o mare varietate de scheme de LDA dezvoltate până în prezent [14], considerăm că este prezentat în Fig. 3.4 o skheiu diferențială așa-numitul aplicat in diagnosticare biomedicale [7]. În acest circuit regiunea de măsurare (sau, așa cum se spune adesea, volumul de măsurare) este format prin intersecția a două fascicule de intensitate egală a elementelor de palpare și primirea de sistem, care cuprinde, în cel mai simplu caz, o lentilă și două deschidere. Semnalul de ieșire al celulei fotoelectrice precum și în construcții, este formată prin amestecarea fotocatodic optică la două câmpuri sale. Cu toate acestea, în acest caz, câmpul mixt, împrăștiate prin cele două fascicule de sondare. O caracteristică a LDA circuitului diferențial este că coordonarea celor două wavefronts ale valurilor împrăștiate se ajunge automat la un unghi solid larg. Datorită mare deschidere de primire diferențială LDA, ele sunt adesea folosite pentru măsurătorile în împrăștierea slab media. Vizualizarea volumului de măsurare la intersecția grinzilor de sondare oferă, de asemenea un plus de confort.
Din cele de mai sus este clar că LDA și dispozitive grele sunt de același tip. Diferența de nume este istoric în natură și pune accentul pe laturile opuse ale aceluiași principiu de măsurare: LDA sunt destinate exclusiv pentru cercetarea laminar scopul și a fluxurilor turbulente, în timp ce GS este, de asemenea, adesea folosit pentru studiul de non-direcțională (difuzie) a proceselor de transport. In ambele tipuri de dispozitive se obține informațiile necesare, în mod tipic de funcțiile de corelare sau spectre ale semnalelor de ieșire fotodetector. Prin urmare, în literatură și folosite denumiri precum corelarea sau spectroscopie Doppler.
În practică, procesarea semnalelor electrice de ieșire din fiecare dintre aceste spectrometre se realizează metode analogice sau digitale, pe care le vom discuta în secțiunea următoare, iar acum uita-te la cerințele pentru elementul de bază al tuturor spectrometre OS - laser. Aceasta se datorează monocromatic, coerent și de mare directivitate radiației laser a devenit posibilă realizarea sistemului de operare în mod eficient. În cele mai multe cazuri, în sistemul de operare spectrometre, concepute pentru studiul obiectelor biologice prin continua cu un singur mod de lasere He-Ne. Nu este comercial lasere disponibile de alim (1- 50 mW) este suficientă pentru a obține suficiente pentru înregistrarea intensității luminii dispersate.
Problema principală este alegerea puterii fasciculului sondei nu este de a face perturbări în obiectul în studiu. Acest lucru este valabil mai ales a obiectelor de viață - celule precum și alte obiecte care absorb puternic lumina. Folosind lasere multimod poate conduce la erori în măsurătorile datorită faptului că distanța în frecvență între modul transversal adiacent poate fi comparabil cu modificări caracteristice în spectrul, care are loc la împrăștierea pe obiecte biologice.
Dacă vorbim despre alegerea lungimii de undă, este important ca cea mai mică, cu atât mai mult lumina este împrăștiată. În plus, extinderea difuzie a spectrului este invers proporțională cu pătratul lungimii de undă. Prin urmare, este mai mic, cu atât mai mare gama și mai moi cerințele pentru sistemul de procesare a semnalului. Prin urmare, în unele cazuri, sistemul de operare utilizat de spectrometre CW laser cu argon care emite în regiunea lungimii de undă verde-albastru. La selectarea o lungime de undă, desigur, ar trebui să ia în considerare spectrul de absorbție al obiectului în studiu. În practică, lasere He-Ne sunt preferate din cauza costurilor mai mici și mai compact. Tipul particular de laser este ales din motive de stabilitate a radiațiilor, deoarece fluctuațiile tehnice reduc raportul semnal / zgomot.