Diagnosticare de obiecte biologice prin măsurarea coeficienților de difuzie - diagnosticare cu laser în biologie și medicină

Diagnosticare de obiecte biologice
prin măsurarea coeficienților de difuzie
difuzie translațională. Până în prezent, cel mai mare număr de studii cu privire la utilizarea imprastiere cvasi elastică spectroscopiei cu laser în biologie se referă la diagnosticul de macromolecule: proteine, acizi nucleici, fragmente și complexele acestora, precum și diferite structuri supramoleculare și celulare, virusuri, bacteriofagi. Tabel. 3.1 prezintă câteva exemple tipice de rezultate ale valorilor razei hidrodinamice ale unor particule biologice prelevate de la [1, 3, 9]. Toate măsurătorile au fost efectuate folosind spectrometre monodinnyh. De remarcat este o eroare de măsurare mică este de aproximativ 1%. Cazuri mai multe erori în studiul obiectelor staționare legate, de obicei, nu metoda de eroare, și o probă cu curățare insuficientă. Prezența unei materii străine (de exemplu praf) sau. unități crește eroarea.
Tabelul 3.1
Coeficientul de difuzie a translației și raza hidrodinamică a unor macromolecule biologice

Valorile staționare de măsurare ale coeficienților de difuzie, iar razele hidrodinamice chiar în greutate nu este o diagnosticare end. Acești parametri sunt foarte sensibili la schimbările condițiilor de mediu (soluție). Prin urmare, cele mai multe studii înregistrate modificări ale parametrilor și DT GGL pentru a diagnostica diferite modificări proprietăți ale particulelor sub influența factorilor externi. Astfel de modificări includ Denaturarea, agregare, reacțiile imune, etc mobilitate conformațională.
Schimbarea particulelor DT în soluție poate avea loc chiar și sub acțiunea fasciculului sondă [17]. Acest lucru se aplică în principal soluțiile foarte ușoare absorbante, un exemplu, care este soluția de hemoglobină. Măsurătorile efectuate pe spectrometru monodinnom la împrăștiere unghi 0 = 90 ° cu procesarea semnalului de analizor de spectru cu 20 de canale cu timp real de determinare a erorii DT nu este mai mare de 0,5%, se obținea metodic importante în funcție de semilățimea spectrului Lorentz al puterii fasciculului sondă pentru moleculele de hemoglobina cu diferite grade de oxigenare (fig. 3.5). Se observă că, în funcție obținută prin extrapolarea către intensități mai mici ale fasciculului sondă, se obține valoarea de intensitate, în care măsurătoarea poate fi efectuată fără schimbarea obiectului în studiu.

Fig. 3.5. Dependența lățimii a spectrului MS a semnalului de puterea fasciculului sondei atunci când este măsurat în soluții de deoxyhemoglobin (1) și oxihemoglobină (2) [17]
Cinetica modificări reversibile ale coeficientului de difuzie a moleculelor de hemoglobină în agregarea lor în complexe datorită desoxigenare chiar nu este posibil de a înregistra în soluție și în interiorul celulelor roșii din sânge intacte - hematiilor [18]. În acest scop, spectrometrul, realizat pe baza microscopului de serie care permite spectroscopia de corelare a fluctuațiilor de intensitate în valoare de aproximativ 8 mm3. Pe o astfel de agregare spectrometru mikroskope- observată a hemoglobinei în eritrocite de pacienți cu secera protoplasme mișcare anemie interior este foarte mic (aproximativ 10 microni) de celule vii (pentru mai multe detalii, a se vedea. 3.5). Asemenea apparatura` pot fi utilizate în mod avantajos, de exemplu, în studierea proceselor care au loc cu modificarea dimensiunilor în timpul biosintezei proteinelor si diferentierea celulelor.
Studiul de agregare a moleculelor în funcție de temperatura. Puternica dependența de temperatură a ratei de creștere a agregatelor a fost demonstrat, de exemplu, pentru a studia agregarea monomerilor de imunoglobuline [19]. La 39 ° C, nici o schimbare a razei monomerilor (5.8 nm la o concentrație de 15,4 mg / ml) nu a fost observat chiar și 60 de ore. În același timp, raza agregatelor a ajuns la 100 nm, timp de 4 h, la soluția este încălzită la 62 ° C
Măsurarea cinetica polimerizarea tubulinei și microtubulilor în autoasamblată vitro la schimbarea temperaturii cvasistatice arătat [20] că concentrația tubulinei în soluție 1,1 mg / ml coeficient de difuzie mediu >t începe brusc, dar a redus la o reversibil temperatură de 20-25 ° C Când acest lucru începe să crească în mod reversibil de polidispersie. Soluție schimbări semnificative și ireversibile începe deja în intervalul de temperatură 45-60 ° C, care, indicând aparent denaturarea proteinei. Creșterea bruscă a temperaturii 7-37 ° C conduce la o modificare >m și gradul de polidispersie este mai mult de trei ori timp de 20 de minute. Adăugarea la o soluție de 100 umol colchicina de polimerizare în soluție inhibată nu sensibilă la temperatură.
Un alt exemplu al metodei de investigare a reacției de polimerizare, care este de mare importanta in diagnosticare biomedicale, este trecerea de fibrinogen

Fig. 3.6. Dependența de timp a intensității difuziei luminii (1) și raza hidrodinamică a moleculelor de fibrinogen (2), după adăugarea soluției de trombină (la momentul t-0)
fibrină și agregarea fibrină. Când rănile de pe corp moleculele de fibrinogen stabile prin enzima trombină transformată într-o formă instabilă, numită fibrina. Fibrina începe să se polimeriza pentru a forma o plasă de agregate dense promoveaza vindecarea ranilor.
Fig. 3.6 scara semilogaritmică arată evoluția în timp a intensității medii a luminii împrăștiate Iv (t) și media rază hidrodinamică GGD (t) de molecule de fibrinogen într-o soluție cu o concentrație de 1 mg / ml, după adăugarea de 0,0033 unități / ml de trombină. măsurătorile MS au fost efectuate pe 60 de canale de fotoni corelator conjugat cu un computer, la 0 = 90 °, 7 = 37 ° C Studiul cineticii reacției până la tranziția în starea de gel (după 6 ore) a permis de a construi un model al interacțiunii moleculelor procesului de polimerizare [21].
Un alt exemplu important se referă la diagnosticul bolilor oculare. Pe baza teoriei de difuzie a luminii elastice a arătat că tulbureala cristalinului ochiului se produce datorită împrăștierea luminii prin conglomerate proteine ​​macromoleculare [22, 23]. Până în prezent, prin spectroscopie de împrăștiere cvasi elastic realizat numeroase studii de mobilitate de difuzie a proteinelor în cristalinul oamenilor și a animalelor, atât in vitro, cât și in vivo [24, 25]. Atunci când obiectele de pe studiile in vitro, lumina difuză cu laser nu-Ne (^ = 632,8 nm) cu o putere de 1-5 mW la unghiuri de aproximativ 45 sau 90 ° la fotomultiplicatorul, din care a fost alimentat la corelatorul digital, care cuprinde cel puțin 100 de canale, și mai departe un calculator pentru prelucrarea ulterioară a funcției de corelare.
Aceasta a constatat ca, in lentila ochiului uman principale conglomerate normale sunt proteine ​​de Pulverizatoare aproximativ 0,5 microni în diametru și particule polydispersed set având diametre cuprinse între 1 și 6 mm [26, 27]. În [28] au studiat distribuția proteinelor aglomerate pentru constructii in lentilele de porc. Se arată că distribuția medie diametrul primului component al particulelor este 15-23 nm, iar al doilea - aproximativ 0,1 microni, a treia - aproximativ 1 micrometru și, în final a patra - 30-70 microni. Distribuția fiecărui tip de conglomerate în ceea ce privește obiectivul este destul de complex.
Astfel, prin spectroscopie dinamic poate observa schimbarea compoziției structurale a cristalinului, manifestat într-o modificare a proprietăților sale de difuzie a luminii. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că pentru a obține rezultate fiabile din puterea de radiație sondare de aproximativ 1 timp de măsurare mW în toate experimentele au variat de la câteva zeci de minute, ceea ce este destul de acceptabil în practica clinică. Prin urmare, este nevoie de cercetări suplimentare pentru a crește sensibilitatea metodei.
Ca un exemplu, studiile cinetice de agregare în reacțiile imunologice pot provoca studiul aglutinare, efectuat pentru determinarea rapidă a bacteriilor [29]. Dacă inspecția vizuală a observației, prima reacție înregistrată după 18 ore, folosind un spectrometru de corelație fotonică în câteva minute pentru a vedea începutul unei reduceri progresive a pantei putrezire a funcției de corelare, arată o creștere a dimensiunii medii a particulelor, și în consecință asupra fluxului de reacție.
Folosind spectroscopia de corelație fotonică permite măsurarea distribuției mărimii agregatelor rezultate de bacterii, inclusiv la diluții mai mari titru, deja în stadiile inițiale ale reacției, adică. E. la toate agregarea a două sau mai multe bacterii. Este, evident, aspecte importante de aplicare ale acestor lucrări. Studii similare au fost efectuate in studiu, iar reacțiile imunologice cum ar fi reacția de precipitare [30] și antigenul - anticorpi [31].
difuzie Rotational. In toate exemplele de mai sus a fost o măsurare a coeficientului de difuzie de translație. Cu toate acestea, în cazurile în care forma particulelor de împrăștiere nu este aproape sferică, și de particulele axial simetrice sau sferice sunt foarte anizotrope în spectrul fluctuațiilor de câmp împrăștiate, așa cum sa menționat, de asemenea, contribuie la orientarea sau dinamica de rotație. Acest lucru se reflectă în funcția de corelare astfel încât acesta este descompus într-o serie de exponențiale în care indicatorii cu excepția DT include, de asemenea, DB - coeficientul de difuzie de rotație. La selectarea unui anumit număr de termeni semnificativi unghi de împrăștiere în serie poate fi redusă la două, ceea ce face posibilă calcularea coeficienților curbei experimentale [1, 9].
O altă metodă constă în măsurarea înregistrării DB a spectrului fluctuațiilor de intensitate ale componentei luminii împrăștiate depolarized [32]. Acest lucru se datorează faptului că această componentă are loc când împrăștierea anizotrop de particule. Înregistrarea luminii depolarizat la unghiuri de împrăștiere mici, în care contribuția difuziei de translație este neglijabilă (expresia (3.4)), DB poate fi măsurată cu mare precizie. dificultate naturală cu această abordare este că intensitatea componentei luminii împrăștiate depolarizată este de obicei mai multe ordine de mărime sub intensitatea componentei polarizată. Cu toate acestea, utilizarea tehnologiei foton de numărare a face ca acest lucru nu este foarte important. măsurători comune
DT și DB oferă informații suplimentare cu privire la forma particulelor de împrăștiere.
rotație suplimentară anizotrop macromolecular anumită contribuție la spectrul semnalului se face rapid de configurare intramoleculare mișcare: .. vibrații la încovoiere molecule lungi sau filamente, dinamica bobinelor polimerice, etc. Metode de calcul spectrele luminii dispersate, ținând cont de aceste mișcări, este în prezent intens dezvoltată [9]. Datele rezultate experimentale paralele sunt folosite pentru a testa diferite ipoteze și modele.