Se prepară țesuturi pentru studii de microscopie electronica - bazele histologie

Datorită faptului că microscopie electronică este din ce în ce parte a practicii de cercetare de laborator morfologic tehnician-histologie necesită un minim de cunoștințe este suficientă pentru a ține materialul și să se pregătească mai întâi blocuri, care pot fi apoi tratate de către specialiști cu un microscop electronic.

dispoziţii generale

Principiul facilității de procesare pentru studiul microscop electronic se bazează pe aceleași condiții ca și prepararea țesuturilor pentru studiul la microscop optic de lumină (fixare, spălare, deshidratare, turnare, secționare).
Cu toate acestea, datorită faptului că avantajul de studiu la nivelul submicroscopic, și cu ajutorul fasciculului electronic (în loc de lumină), metoda de preparare a obiectului și tehnica de obținere a secționării sunt unele caracteristici ar trebui să fie conștienți.

Video: Metode de tesut studia

1. Este necesar să se concentreze atenția maximă asupra modului de a evita (sau scădere maximă) modificări ale microstructurilor de viață cauzate de procese privarea de oxigen și de degradare care apar la terminarea obiectului vieții.
2. Deoarece membranele biologice, implicate în formarea majorității microstructuri vii au o compoziție lipoidă-proteină poate utiliza numai acele încuietori care nu se dizolva lipidele și proteinele (tetroxid de osmiu, formol, permanganat de potasiu). Astfel de cleme alcool, acetonă, diclorura de mercur (sublimat coroziv), distrugând structurile submicroscopice imposibil de electroni examinarea microscopică a obiectului face.
3. Grosimea secțiunilor de testare nu trebuie să depășească 0,3 microni (300 NM1), m. E. Trebuie să fie ultrathin. o imagine obiect într-un microscop electronic apare datorită diferitelor grade de deviație (dispersie) a electronilor atunci când trec prin diferite porțiuni tăiate densitate, astfel încât o mai mare grosimea feliilor pentru imaginea principală se vor suprapune imagini ale parcelelor individuale situate deasupra (în direcția fasciculului de electroni), care întotdeauna Aceasta atrage după sine o pierdere de claritate.
4. necesare pentru a obține secțiuni ultrasubțiri că materialul de umplutură posedă anumite proprietăți (elasticitate, densitate, transparență, etc.). In general, pentru obiectul studiilor de electroni microscopice turnat in (polimer) mediu sintetic: rășini epoxidice și poliester, iar în unele cazuri, și gelatină.

1). Nm (nanometri) -1 / 1000mikrona.

Video: umeri Anatomia omului și arme partea 1

Luând materialul și de fixare

Baza de fixare compus este tetraoxid de osmiu cu diferite structuri de obiecte. afectează în mod direct reactivul pe material nu poate fi, pentru că există schimbări semnificative în componentele sale structurale. Prin urmare, procesul de fixare este împărțit în două etape: prefixare și postfiksatsiya. Pentru o mai bună siguranță a structurilor necesare pentru aplicarea reactivilor având particular pH și izotonicitate, care valori sunt vederi determinate țesut fixated. Pentru prefixarea aplicat soluție de glutaraldehidă tamponată (concentrație de obicei de 3%). Postfiksatsiyu realizată în soluție de tetroxid de osmiu 2%.
Înainte de a trece de a lua materialul, ar trebui să pregătească toate soluțiile necesare.
Prefiksator: un tampon fosfat 0,1 M (pH 7,4), se adaugă soluție de clorură de calciu 1% (rata de 0,5 ml per 100 ml de tampon). Pentru a evita formarea de precipitat a adăugat ultima picătură cu picătură, agitând periodic (fără tampon de clorură de calciu poate fi depozitat pentru o perioadă lungă de timp, cu clorură de calciu - până la 2-3 zile). Apoi, pe această bază, se prepară o soluție de 3% din glutaraldehidă.
Postfiksator: un tampon fosfat 0,1 M (pH 7,4) s-a adăugat tetroxid de osmiu și o soluție de glucoză (pentru a crea o soluție izotonică) în conformitate cu următoarea rețetă: 14 ml 6,71% Na2H PCL N2O- 8,5 ml de 2,52% NaOH - 5,5 ml de 5,4% soluție glyukozy- 27,5 ml de soluție 2% tetroxid osmiya- ml de soluție 1% 0,3 clorură de calciu.
Prepararea unei soluții 2% de tetroxid de osmiu necesită o îngrijire specială. Fiola cu tetraoxid de osmiu se spală bine și apoi nadpilivayut prin spălare cu apă distilată, plasată într-un balon curat complet închis, care a fost turnat în cantitate de apă distilată, necesară pentru a obține o soluție de 2%. Apoi curățați diviziunea baghetă de sticlă fiolă (sub apă). O soluție limpede este ușor gălbuie (soluție poate fi depozitată pentru o lungă perioadă de timp în frig pentru a precipita cristalele de culoare închisă).
Pe lângă reactivii de mai sus, trebuie să aibă un alcooli baterie concentrații ascendenți (50, 70, 80, 95 și 100%), ca mediu cel mai frecvent utilizate de turnare - și rășina epoxi Epon Araldite - insolubil în apă și materialul înainte de a turna, este necesar să se deshidrateze. Datorită faptului că mici cantități de soluții utilizate (5-10 ml) în timpul prelucrării, se recomandă să se folosească vasele de capacitate corespunzătoare (de exemplu, sticle din penicilina).
Având reactivii necesari, mediul înglobare și capsulele gelatinoase (№ 1 și 2) pot fi gata să înceapă.
Există două moduri de bază de fixare: 1) soluție de perfuzie a organului durata de viata de 3% glutaraldehidă și 2) prin impregnarea unei mici porțiuni a corpului de testare. A doua metodă este folosită mai des, deoarece este mai ușor punct de vedere tehnic și necesită reactivi mai puțin limitate. Numai după ce toate lucrările pregătitoare poate începe să ia materialul și fixarea acestuia. Acest lucru se face după cum urmează. Animal fixe și anesteziate cu Nembutal sau eter (prima metodă este preferabilă). Apoi, accesul la organul țintă (în acest caz, animalul trebuie să respire, iar inima lui funcționează bine).
Prefixare: expunând suprafața corpului printr-o seringă aplicată l 25-30 ml dintr-o soluție 3% glutaraldehidă, excizat după 5-10 min un brici ascuțit subțire (1 mm) țesăturii de bandă și sol în picătură cu picătură prefiksatora, turnat pe o placă de plexiglas (cantitatea de bucăți tocate materialul nu ar trebui să fie mai mult de 1 mm3). Apoi, pipeta se colectează bucăți de picături prefiksatora se transferă într-un flacon de cântărire cu o nouă porțiune prefiksatora și plasată timp de 1-2 ore în frigider. Apoi, bucățile de material au fost spălate în patru porții de tampon fosfat cu clorură de calciu timp de 15-30 min, și trece la pasul următor.
Toate acestea și manipulare ulterioară trebuie efectuată cât mai repede posibil și la o temperatură de 0-4 ° C, care în timpul prelucrării cu preparate soluții a fost plasat într-un pahar cu gheata.
Postfiksatsiya :. Bucăți de țesut au fost plasate în postfiksator timp de 2 ore După spălarea produsului de fixare în patru porții de tampon fosfat proaspăt cu clorură de calciu, timp de 5 minute.

Deshidratare, impregnare și umplere

Deshidratarea: bucăți de țesut fixe și spălate este trecut prin concentrația în creștere a bateriei de alcool în modul următor:
Alcool 50% trei porții "70%" "

în frig
Dacă se dorește, în această etapă, este posibil să dețină obiectul 24 de ore.
Alcool 80% trei porții
"96%" "
"100%" "

la temperatura camerei
Apoi se procedează la impregnarea și umplere.
In prezent, mai multe metode sunt folosite pentru a umple mediul sintetic (Araldite, Epon, metacrilați, vestopal și colab.).
Aici este una dintre cele mai frecvent utilizate metode de impregnare și completarea Epon.
Pentru a face acest lucru, se prepară un număr de compuși.
Amestec A: Epon 812 (62 ml) + Epon DDSA (100 ml).
Amestec B: Epon 812 (100 ml) de 4- Epon MNA (89 ml).
Datorită faptului că componentele trebuie să fie amestecate consistență vâscoasă, trebuie să le se amestecă cu atenție în procesul de coacere. Fiecare amestec poate fi preparat pentru utilizare ulterioară și se păstrează în frigider timp de până la 1-2 luni.
Înainte de utilizare, cantități egale luați amestecurile A și B și a adăugat reactiv-DMR-30 * (bazat pe amestecul de 10 ml de A + B 0,2 ml DMR-30), din nou, a fost amestecat complet pentru a obține o masă omogenă.

* Termenul de valabilitate al tuturor componentelor utilizate mediile sintetice nu trebuie să depășească 1 an.

Impregnarea: pune piesele în mediu de alcool 100%, iar amestecul total de Epona. (A + B = 1: 1) 1 oră, apoi dețin trei porțiuni din amestec complet Epona (A + B = 1: 1) la 1 oră fiecare.
În acest finisaj de impregnare și du-te la pasul următor.
Umplerea: distribuită prin intermediul capsulelor cu pipeta, pre-uscat într-un cuptor, amestecul complet Epona (A + B = 1: 1). sticlă bucăți de țesătură impregnate cu rășină buclă de captare sau un forceps subțire curbate și dispuse unul câte unul în fiecare capsulă. Fără a da piese depună pe fundul capsulei plasat într-un termostat pentru polimerizare. Stoving este următoarea: 1) la o temperatură de 35 ° C -24 2) 45 ch ° C - 24 ch 3) 60 ° C - 24 ore.
Apoi unități polimerizate scos din cuptor. După 1-2 zile, blocurile au fost spălate de capsule de gelatină. Pentru aceasta, ele sunt plasate în borcan cu apă fierbinte timp de 10-20 min. Blocuri finite prinse în ultratome blokoderzhatel pe zi, într-o piramidă ascuți și pentru a începe de tăiere în materialul.

Video: Diagnosticul și monitorizarea rezultatelor educaționale în lecțiile de biologie la școala de bază