Folosirea spectroscopiei Raman in studii biochimice - diagnostice cu laser in biologie si medicina

6.2 Aplicarea spectroscopie Raman
în studiile biochimice
Studiul proteinelor. obiecte clasice pentru utilizare spectroscopie Raman la biomolecule sunt proteine ​​și componente ale acestora. Mai mult decât atât, în cazul în care primul spectrele Raman ale proteinelor au fost obținute de la sfârșitul anilor '50 prin lămpile, în ultimele două decenii ca este folosita o sursa de excitație laserele exclusiv.
Scopul majorității cercetării realizat metode KR este studiul structurilor moleculare si studiul grupelor funcționale individuale, determina activitatea lor biochimice [9, 10].
Dintr-o convențional (spontan) Spectrul Raman al unei proteine ​​poate furniza informații cu privire la caracteristicile sale structurale, cum ar fi catenă medie conformația polipeptidic primar [P. 8]. În special, aceste informații sunt conținute în poziția și conturul benzii 1 și amida-amida-3. Într-adevăr, fiecare grupă amidă în molecula de proteină are amidă linie intensă 1, a cărei poziție în spectrul depinde de conformația acestei porțiuni a moleculei. Majoritatea grupărilor amidă din compoziție, de exemplu, o conformație elicoidală suferă aproximativ aceeași influență din atomii învecinate și, astfel, are aproximativ aceeași frecvență de linie de amidă (cm-1 1645- 1657). 1
grupări amidice sunt compuse din (molecule fragment 3-structurale au o frecvență ușor diferită a acestei linii (1665-1672 cm-1). Deoarece structura secundară reală a complexului moleculei de proteină, observată în spectrul Raman al acestei proteine ​​bandă amidă 1 reprezintă superpoziție de linii individuale.
Același lucru se aplică benzii-amida 3 care apar în diferite linii de grade: 1260-1295 cm-1 (slab), 1230- 1240 cm-1 (tare) și 1245 ± 3 cm-1 (larg) referitoare respectiv ka elicoidal, (5-structurale conformații și neordonate.
Acest lucru arată că, prin analiza formei și a poziției profilului benzii maxime (de exemplu, banda de expansiune spectre experimentale dar structuri separate), este posibil să se obțină evaluarea cantitativă a conținutului diferitelor tipuri de structuri din proteina de testare.
Material extensiv acumulate până în prezent stabilirea structurii secundare a diferitelor proteine, în mare parte bazat pe studiul spectrelor Raman de polipeptide ale modelului structurii cunoscute [9, P. 8].
Am demonstrat posibilitățile spectroscopie Raman în studiul conformației proteinelor și polipeptidelor în soluții apoase și în stare solidă, într-un exemplu de a studia structura și interacțiunea C-proteină și miozina [11]. Aceste proteine ​​cu o greutate moleculară de 140 OOO și 460000, respectiv, au fost izolate din mușchiul scheletic de iepure. Imprastiere cu laser Ar excitat (Ji = 488,0 nm), înregistrarea a fost realizată cu o rezoluție de 5 cm-1.
Fig. 6.4 prezintă spectrele Raman ale C-proteina, miozina și complex. Pentru proteina spectru C (fig. 6.4a) amida caracterizat prin puternica linie-1 (1668 cm -1) și banda relativ bine definit de amidă 3 (1242 cm-1). O astfel de poziție și raportul lor indică faptul că conformației proteinei C sunt moleculele p-aleatoare structura bobinei și în aproximativ egală proporție.
Pentru miozinei (fig. 6.46) se caracterizează printr-o linie de împrăștiere slabă în amida-3, în timp ce pendularea manifestă amidic 1 puternică linie 1653 cm-1. Există, de asemenea, o linie semnificativă la 939 cm-1, corespunzând vibrațiilor longitudinale ale moleculei principale de lanț polipeptidic. Acest lucru indică faptul că majoritatea moleculelor myosin este în conformație-o elicoidal și o mică parte din ele - în | $ -structures conformație.
In formarea miozina complexe - molecule de C-proteină sunt atașate la molecula myosin din urmă la mai multe puncte, în special în lanțul ușor și HMM în subfragment 2-coada a moleculei. O astfel de interacțiune ar părea să ar putea avea un impact semnificativ asupra ambele conformații ale moleculelor. Cu toate acestea, analiza spectrului Raman al complexului (Fig. 6.4v) arată că modificările conformaționale ale moleculelor nu are loc în soluție apoasă sau în stare solidă.

Fig. 6.4. Spectrele Raman ale unei - C-proteină (soluție 3%); b - proteină miozinei (6% din tabletă), un - miozinei complex - proteina C (6% din tabletă). Măsurătorile au fost efectuate în aceleași condiții: în prezența 0,09 moli de KC1 și 5 * 10&ldquo-3 moli K3PO4
<оН=7,0) [11]
Folosind metodele de CRR, poate, în multe cazuri, să examineze grupurile atomice individuale și funcțiile lor într-un biomolecule. Astfel, rezonant CARS realizare utilizat pentru a studia molecule complexe de P-caroten, vitamina Bi », metalloporphyrin [12]. De interes este studiul interacțiunii dinucleotida coenzimei flavin adenin (FAD) din proteina glucoza-oxidaza enzima [13, 14]. O caracteristică interesantă a acestor experimente este faptul că maximă FAD banda de absorbție devine-Stokes anti lungime de undă a semnalului, mai degrabă decât lungimea de undă a pompei. În cazul în care rezonanța este lungimea de undă a pompei, calitatea spectrelor obținute este drastic deteriorat. În [14] a confirmat experimental prezența FAD legături de hidrogen - enzimă.
Să considerăm un exemplu mai detaliat prin studii mecanism ASRS belka- activitatea catalitică a enzimei a-chimotripsina [15-17]. Site-ul activ al moleculei include o grupă rest imidazol Gis57 legat prin legături de hidrogen cu resturile Asp 102 și Ser 195, formând astfel un sistem de transfer de sarcină. Abilitatea Descrierea detaliată a procesului care apar în situsul activ al unui chimotripsinei, implică faptul că informația cu privire la gradul de grup protonare Gis 57: procesul de transfer de proton în legături de hidrogen conduce la o schimbare în protonarea grupării imidazol, care ar trebui să se reflecte într-o schimbare în spectrul său de vibrație.
Intr-adevar, spectrele CARS permit raportul intensităților anumitor linii (de exemplu, linia de 1164 cm-1) pentru a obține informații cu privire la conținutul acestui sau (protonate sau neprotonat) formează un imidazol. Utilizarea ASRS vă permite să înregistrați o linie de imidazol care nu se manifestă în spectrele Raman spontane.
Fig. 6.5 prezintă un circuit spectrometru CARS construite special pentru studiul biomoleculelor, pentru care utilizează un laser în impulsuri cu putere medie ridicată și relativ scăzută [4]. Baza de spectrometru este un laser YAG: Nd, lucreaza intr-un acusto-optic-Q pornit și blocat-mode. Radiația de ieșire este Trenurile de impulsuri următoare o frecvență de 5 kHz. Durata unui impuls individual dintr-un tren de 80-85 ps, putere puls de 0,7 MW. oscilator de radiație (1060 nm) după cristale de frecvență dublare LiIOs folosit „semnal“ canal și un canal sincron al pompei laser cu colorant. reglaj continuu lungimea de undă a lasing acest laser se face în intervalul de 0,56-0,60 mm, ceea ce corespunde diferenței de frecvență gama vx-v2 = 950-2100 cm-1. generând o lățime de linie de 0,5 cm-1, durata impulsului 50-60 ps, ​​putere puls de 20 kW. Pentru a reduce media puterii radiate a doua armonică (530 nm) este incident pe eșantion este eliberat din tren impuls unic. În radiația „semnal“ canal are o putere medie de 30-40 mW, puls - 15 kW, lățimea impulsului de 50-60 ps.

Fig. 6.5. CARS spectrometru organigramelor [4]: ​​1 - YAG: Nd laser, 2 - cristale LiI03, 3 - camera "agat" 4 - oglinzi, 5 - Colorare cu laser 6 - Schema de alocare a unui singur impuls 7 - Fresnel romburi, linie de întârziere 9 - - 8 oglinzi dicroice, 10 - cuvetă, 11 - lentila, 12 - deschidere 13 - Glan prismă 14, - un filtru de interferență, 15 double monocromator 16 - PMT 17 - analizor multicanal, 18 - module CAMAC 19 - plotter, 20 - calculator
A doua armonică a vx și colorant v2 cu laser este focalizată de către o lentilă pe un eșantion de celule. Semnalul generat anti-Stokes este colimată și este focalizat de lentile pe fanta de intrare a monocromator. Pentru a suprima nerezonanți polarizarea de fond liniară a pompei și radiații vx v2 sunt crescute folosind un Fresnel romb. Prin rotirea analizorului (Glan prism) lângă o poziție de suprimare maximă a semnalului nerezonanți atinge o modificare semnificativă a spectrului. Acest lucru face posibil controlul formei spectrului datorită modificărilor condițiilor de interferență ale semnalului de rezonanță și componentele nerezonanți.
semnal CARS, filtrată spectral de lumină rătăcit folosind un monocromator dublu cade pe FZU funcționează în modul de numărare de fotoni. Informațiile sunt stocate într-un analizor multicanal. Înregistrarea, de prelucrare a semnalului și colorant de transformare cu laser fabricate cu ajutorul micro-calculatoare.
Prin amplitudine-polarizare suprimare fundal nerezonanți prin folosirea acestui aparat ar putea, în special, să stabilească mediu hidrofob al inelului de imidazol în diferența dintre molecula subglobules-himogripsina și în care site-ul său activ situat. Fig. 6.6 prezintă spectrul de amplitudine și polarizare ASRS-chimotripsina într-un interval de 960- 1060 cm-1.

Fig. 6.6. Spectru CARS unei soluții apoase a unei chimotripsinei la unghiuri diferite între axa de polarizare a analizorului și vectorul de polarizare a semnalului nerezonanți <р: — 1,0° (а), 1,5° (б),
0 ° (c) [4]
În cadrul acestui interval minciună frecvență de oscilație caracteristică a aminoacidului resturile de fenilalanină (1004 cm -1), triptofan (1014 cm-1), precum vibrațiile de întindere ale C-N (1033 cm-1). Interesant, toate resturile șase fenilalanină care alcătuiesc proteina care se gaseste in imediata apropiere a centrului activ.
Toate spectrele au fost obținute în condiții odinakozyh și diferă unul de altul prin unghiul dintre axa de polarizare a analizorului și vectorul de polarizare a semnalului nerezonanți (<р). Помимо подавления нерезонансного фона поляризационная методика позволяет управлять формой спектра, выделяя или ослабляя в нем те или иные линии. В частности, в эксперименте выявлена линия 1010 см-1, которая совсем не проявляется в спектрах спонтанного КР. Вопрос о соответствии этой линии определенным элементам вторичной структуры белка является предметом будущего исследования.
O oportunitate unică de a studia statutul grupurilor atomice individuale situate pe macromoleculele de suprafață, de asemenea, oferă spectroscopiei SERS 17, 18, 19]. Pentru un număr mare de proteine ​​si aminoacizi care constituie ultimii ani cu ajutorul acestei metode este investigată. In particular, pentru proteinele solubile în apă, a fost demonstrat [19] că câștigul Raman este observată numai pentru grupuri de atomi, care sunt pe suprafața globulelor de proteine ​​și interacționează cu metalul. În același timp, nu sunt detectate linia 1 și spectrele SERS amidă-amida-3. Aparent, acest lucru se datorează efectului de screening al lanțurilor peptidice grupuri laterale de resturi de aminoacizi care le separă de la suprafața metalului și împiedică amplificarea eficientă a vibrațiilor corespunzătoare.
Caracteristici SERS când proteinele studiază demonstrează un exemplu de proteină de membrană fotosensibil - rodopsina bacteriană (BR). Molecule acestei proteine ​​transmembranar se realizează transferul de protoni. Pentru a înțelege mecanismul molecular al funcționării BR este necesară determinarea centrului său topografie cromatofor (poziția reziduurilor retiniene). metoda spectroscopiei SERS a fost utilizată pentru a determina locația retiniene în raport cu suprafața membranei [20].
În adsorbție pe membrană violet hidrosol de argint conținând BR poate reacționa cu argint ca latura exterioară și interioară (fig. 6.7). Prezența benzilor în spectrul ieșirii cromofor oscilație confirmă apropierea suprafeței retiniene a membranei. Rețineți că similitudinea SERS spectre și RMR în 1000-1400 cm-1 indică faptul că proteina de adsorbție lanț polienică retinal trans păstrează pe deplin caracteristică BR în suspensia apoasă.
Studiul acizilor nucleici. Originea spectru Raman al ADN-ului a fost obținut în 1968, G. [21]. Din acest punct am realizat multe studii prin spectroscopie Raman bazelor și nucleotide libere, complexe lor cu proteine ​​[22], metale grele și alte elemente și compuși. S-au obținut spectrele Raman ale soluțiilor de virus naturale [23] și cromozomi [24].

Fig. 6.7. membrane violet suspensii apoase CRR spectre variind de concentrație: A - în 10_6 - 10-7 mol / l, b - membrane violet spectru SERS adsorbite pe hidrosol de argint, concentrația de 10-7 mol / n- în intervalul inferior de sensibilitate este crescută în de două ori [20]
Posibilitatile spectroscopiei Raman pentru a studia diferite caracteristici ale acizilor nucleici poate fi demonstrat prin experiment ADN de topire [25]. Fig. 6.8 prezintă temperaturile care rezultă în spectrele Raman diferite de ADN izolat din timus de vițel. Deoarece temperatura ADN de topire în intervalul 80 până la 85 ° C, apoi spectrele Raman poate fi văzut ce se întâmplă cu moleculele în timpul topirii.
Studiul dependenței de temperatură a spectrelor Raman ca profilul uns de temperatură a intensităților

Fig. 6.8. Spectrele Raman de soluție apoasă de ADN izolat din timus de vițel, la o temperatură de 98 (a), 84 (b) și 25 ° C (c) - pH = 7,0 [25)
și frecvențe diferite legături intermoleculare pot fi atribuite la diferite categorii: 1) baze de conectare, care corespunde intensitati scădere reversibile ale liniilor, punctul de topire de mai sus, și anume, anumite fenomene predplavleniya- 2) bazele de racordare pentru care dependența de temperatură este slabă sau absentă .. - 3) coloana vertebrală de comunicare dezoksiribozofosfatnye pentru kodebany caracterizată prin absența dependenței de temperatură sub punctul de topire și picătură ikuensivnosti puternic la acest punct.
Unele linii ce corespund celor patru baze (Alenin (A) - timina (T), citozină (C) și guanină (G)), sunt supuse creștere treptată în intensitate odată cu creșterea temperaturii sub punctul de topire. La atingerea acestui punct există o creștere bruscă a intensității acestor linii (de exemplu, linia T 1240 cm-1 în Fig. 6.8). Aceasta sugerează că unele schimbări în aranjamentul de bază în raport cu altele (stivuire verticală) începe să apară, deoarece temperatura de 50 ° C, e g. Substanțial sub punctul de topire. La atingerea punctului de topire a moleculelor de ADN schimba conformația lor, mergând de la D-formă pentru a forma bobina dezordonate la întâmplare.
Sensibilitate ridicată prin detectarea modificărilor conformaționale subtile in ADN-ul a devenit spectroscopiei SERS. În special, a înregistrat efecte subtile de destabilizare a dublului helix ADN, care rezultă din acțiunea chiar și dozele mici de radiații [27] și factorii mutageni [28] ionizanta.