Detectarea polizaharide - baza de histologie

Detectarea polizaharide (acide și neutre)*
Polizaharide - zaharuri cu masă moleculară înaltă se găsesc în țesuturile organismului în formă pură (glicogen) și în combinație cu alte substanțe (mucopolizaharide mukoproteidov, glicoproteine). Glicogenul este o rezervă de zaharuri in organism si se gaseste in principal in ficat si muschi. Mucopolizaharide - o polizaharidă care conține hexosamine ca una dintre componente. Ele sunt o componentă esențială a substanțelor mucoide în organism, de ce, și de a lua numele lor (mucus latin -. Mucusului).

* mucopolizaharide acide este numit acum glicozaminoglicanilor, și neutru - glicoproteine. Cu toate acestea, ne rezervăm textul termenilor vechi, așa cum apar ele în cele mai multe dintre liniile directoare metodologice existente pentru histochimie.

Mucopolizaharide împărțit în neutre și acide. Recente răspândite în organismul animal este larg (mucus epiteliul tractului digestiv și glanda cel mai ductal, substanță de bază a țesutului conjunctiv, și așa mai departe. D.), acestea sunt la rândul lor împărțite în (acid hialuronic) simplu și esterii (mukoitinsernaya heparină și condroitin acid-). Mucopolizaharide, ferm legat de o mukoproteidov și glicoproteine ​​de proteine ​​numite. Ele fac parte din substanțe mucoide și secreții ale mai multor glande.
Polizaharidele și complexele lor - compusi foarte labile, care sunt receptive la o varietate de modificări ale proceselor metabolice din organism.
polizaharide joacă un rol important în procesele fiziologice normale, și ocupă o poziție de lider în dezvoltarea unui număr de procese patologice, în special cele legate de boli ale tesutului conjunctiv. Prin urmare, studiul dinamicii schimbării în conținutul și distribuția diferitelor componente de polizaharide din organism este de mare importanță în practica de cercetare și identificarea și diferențierea polizaharide - una dintre secțiunile esențiale ale histochimie.

Reaction - acid periodic Schiff (PAS-reacție)

Substanțele bază histochimie care conțin componenta polizaharidică este acid Schiff periodic reacție (PAS-reacție).
Folosind această reacție poate fi detectat de glicogen mukoproteidov, glicoproteine ​​și glicolipide.
soluţii de lucru
Reactiv Schiff (a se vedea mai sus metoda de preparare -. 270.).
Sulfuros apă. La 200 ml apă distilată, se adaugă 4 ml de HC1 concentrat. În 25 ml de apă distilată, se dizolvă 4 g de sulfit de sodiu anhidru. Ambele conectați soluție.
O soluție de periodat. Se dizolvă 1 g periodat de potasiu sau periodat de sodiu, 2,5 g în 100 ml de apă distilată.
metodă
(Locks Shabadash alcool, formol, fluid Carnoy de umplere lichid Tsenkera- în parafină extemporaneu).

1. Secțiunile 5-7 microni deparafinate grosime și adus la apă.
2. Cufunda într-o soluție de acid periodic timp de 5-10 minute, sau sodiu sau potasiu periodat timp de 20-30 minute.
3. Clatiti bine în două sau trei porții de apă distilată (3-5 min) pentru a îndepărta restul de acid iodic.
4. Adăugați la reactivul Schiff timp de 10-20 de minute.
5. Procesul în trei porțiuni de apă sulfuroasă proaspăt preparată (1-2 min).
6. Se clătește cu apă de la robinet timp de 10 min, clătite în apă distilată.
7. Deshidrata, lumina și de a încheia în Balm (dacă doriți să vopsi miezul, după a șasea etapă a secțiunilor produc contrast cu hematoxilină).

Rezultat. substanță polizaharidelor este colorat de culoare violet sau roșu-purpuriu. mucopolizaharide neutre sunt, de obicei de culoare roșie violacee, glicogen - mai inchisa.
Notă. reactiv Prelucrarea Schiff trebuie efectuată într-un închis cupe biologice,, învelite în hârtie neagră. O porție de reactiv poate fi utilizat în mod repetat (până când culoarea roșiatică).
Dacă felii apar pete murdare-maro, acest lucru indică faptul că soluția de oxidare nu a fost complet spălate înainte secțiuni de prelucrare Schiff.

agenți de diferențiere care dau o Schick reacție pozitivă

reacția PAS pozitiva, adăugarea de glicogen este grupul de polizaharide -glikolipidy, glicoproteine, mukoproteidov, precum și unele substanțe nu conțin carbohidrați: fosfolipide, lipoproteine ​​si unele lipide. Prin urmare, pentru a determina care dintre substanțele prezente în țesuturile studiate, în fiecare caz, reacții suplimentare trebuie efectuate pentru clarificarea substanțelor PAS pozitiv.
Defalcarea glicogen. Se aplica produsul finit sau diastazei enzimă conținută în salivă.
În primul caz, o soluție de 0,1% diastazei 0,02 M tampon fosfat pH 6,0 s-a adăugat clorură de sodiu (sare obișnuită) la o concentrație de 0,8% în al doilea saliva colectat câteva cuburi și se filtrează într-un pahar.
Metoda. 1. După Deparafinizarea la apă și ajustând una sau două felie plasat în diastazei (sau salivă) soluție și a pus într-un termostat la 37 ° C timp de 30-60 min, se lasă să se odihnească în apă.

1. Secțiunile au fost spălate în apă distilată, împreună cu alte reduceri (enzime netratate) și supus reacției prin metoda Schick descrisă.

Rezultat. 1. Lipsa de colorare în secțiunile incubate într-o soluție care conține enzima (de control), indicând faptul că reacția PAS-pozitiv în celelalte secțiuni datorită prezenței în țesuturi glikogena- 2) în cazul în care toate secțiunile sunt colorate la fel, inseamna ca glicogen este absent și substanțe colorante cauzate de alte substanțe, dând dacă secțiunile de control au fost colorate mai puțin intens decât celălalt pozitiv reaktsiyu- PAS-3), trebuie să se considere că o parte din materialul pozitiv PAS este glicogen.
reacția de acetilare. secțiunile de control tratate timp de 1-24 ore la 21 ° C într-un amestec de ml de anhidridă acetică și 24 ml piridină uscată, se spală cu apă, tratate timp de 1 oră într-o soluție de hidroxid de sodiu (0,4 ml de NaOH în 100 ml apă distilată), spălată în apă și se efectuează reacția Schick. Rezultatele negative indică faptul că reacția inițială a fost datorată prezenței substanțelor carbohidrați (1-2 grup glicol).

Video: Biologie. Detectarea grăsimilor din cereale. video de 2

extracția lipidelor. Secțiunile au fost incubate timp de 29 de ore mocnind într-un amestec format din diferite părți de cloroform și metanol, la 58 ° C Dacă culoarea PAS-reacție dispare sau scade, aceasta sa datorat substanțelor lipidice.
Reaction - Acid Schiff-peracetic. Secțiunile au fost pretratate 1-2 ore într-o soluție de acid performic sau peracetic și apoi colorate cu reactivul Schiff. Prezența în aceste structuri, vopsite în culoarea roșie indică lipide cu legături nesaturate (fosfolipide și cerebrozide).
secțiuni de prelucrare cu tripsină. Dacă reacția PAS-pozitiv dispare sau scade în felii de pre-tratate cu tripsină, apoi sa datorat substanțelor proteice.

Divulgarea de glicogen carmin cea mai bună metodă

 (Broaste - Buena, Carnoy, un alcool, formol, etc.).
soluţii de lucru
Soluția de bază de carmin. Se dizolvă în 60 ml de apă distilată, 2 g de carmin, 1 g de carbonat de potasiu și 5 g de clorură de potasiu. Soluția rezultată se fierbe timp de 5 min (evitarea fierbere rapidă), se răcește și se filtrează. Apoi se adaugă filtratul la 20 ml soluție de amoniac 28%. Păstrat la frigider, la 0-4 ° C, soluția improprii timp de 3 luni.
O soluție de carmin pentru colorare. Se scurge 8 ml din soluția stoc, 12,5 ml de amoniac (densitate 0,880) și 24 ml de metanol (treci soluție 1-2ned).
Cea mai bună soluție pentru diferențiere. La 8 ml de etanol absolut adăugat 4 ml de metanol și 10 ml apă distilată.
metoda de colorare (secțiuni de parafină)

Video: Peacock colegii de la Minsk Zoo.

1. Adu-secțiuni la alcool absolut.
2. Pune în celloidin soluție 1% timp de 2-5 min.
3. Uscate în aer.
4. Adu prin alcooli cu apa.
5. Dye gemalaunom Ehrlich 5 min.
6. Se clătește cu apă și se diferențiază nuclei pete sub 1% alcool acidifiat.
7. Se clătește în apă distilată.
8. Pune în carmin pentru colorare soluție timp de 15-30 min.
9. Cea mai bună soluție în diferențiată (non-pre-clătire în apă) de la 5-10 secunde la câteva minute, până când nor colorant oprire depart (în cazul în care soluția se murdărește rapid, schimbarea).
10. Se clătește în alcool 80%.
11. Deshidrata, ușura în sus și conectați-vă în Balm.

Atunci când pictura tselloidinovyh taie primii trei pași sunt omise, deoarece acestea sunt concepute pentru a oferi protecție tselloidinovoy secțiuni.
Rezultat. Nucleele de albastru inchis glicogen rosu, luminos.
Notă. Datorită faptului că structura colorantului includ amoniac, coloranți să fie efectuate în vase închise ermetic. secțiuni de control tratate cu diastazei ca la reacția Schick.