Identificarea celulelor nervoase prin colorare vitală cu albastru de metilen - baza histologiei

material produs după colorare de fixare, prin urmare, toate soluțiile de lucru, atât pentru vopsire cât și pentru fixarea trebuie să fie pregătite în avans.

soluţii de lucru

Mai întâi a fost preparată o soluție concentrată de metilen 1% albastru. În 100 ml de lichid Ringer - Locke dizolvă 1 g albastru de metilen. Soluția poate fi depozitată pentru o lungă perioadă de timp. Pentru vopsirea este diluat cu Ringer-Locke câteva ori lichid.
Ringer lichid - Locke ca și soluție izotoniche9komu cuprinde substanțe de clorură de sodiu în țesuturile animale. Atunci când se lucrează cu mamiferele pot consuma Ringer lichid - Locke următoarea compoziție.

Dacă echipamentul adecvat este disponibil, Ringer lichid - Locke înainte de experiment poate fi saturat cu oxigen, care îmbunătățește durata de viață a colorării celulelor nervoase.
necesară utilizarea unui preparat cristalin chimic pure pentru soluția de metilen colorant albastru, care este o sare dublă sau hlortsinkovuyu uz medical chimic metilen albastru pur, lipsit de clorură de zinc.
Pentru fixarea materialului consumate soluții picrat de amoniu sau molibdat de amoniu. Utilizați numai molibdat de amoniu cristalin (7,5 g din această sare a fost dizolvată în 100 ml de apă distilată, după care soluția filtrată).
picrat de amoniu a fost dizolvat într-o cantitate de circa 1 g la 100 ml de apă încălzită (60 ° C) distilat. Se prepară soluție trebuie imediat înainte de experiment. Utilizați numai izomer roșu de sare. La această soluție 25% de amoniac a fost încălzit într-o baie de apă (într-o glugă!) Și apoi se adaugă în porțiuni mici cristaline acid picric, până când soluția devine saturată (m. E. Până la dizolvare se oprește). După încălzirea suplimentară a soluției pe suprafața apare peliculă subțire de cristale mici. După aceea, încălzirea a fost oprită. Răcirea trebuie efectuată lent (într-o baie de apă, sau înfășurați un balon prosop). După 12 ore, lichidul decantat și cristalele care rezultă din picrat de amoniu dizolvat imediat în apă distilată pentru a se obține o soluție saturată (picrat de amoniu uscat trebuie manipulat cu mare grijă, deoarece cu agitare viguroasă și explozie încălzită poate avea loc). a adăugat apă distilată, astfel încât să rămână în partea de jos a unui număr suficient de cristale, punct de topire. E. Soluția a fost saturată. Înainte de utilizare, cele două soluții au fost răcite la 3-5 ° C Folosind soluția din nou s-a adăugat apă distilată până la saturație.

colorit

Tehnica dezvoltata de A. S. Dogiel. Există diferite metode pentru introducerea colorant in organism, elementele nervoase din care aceasta trebuie să le dezvăluie. soluție de albastru de metilen se introduce prin vasele sanguine sau excizată din organul corp este plasat direct în soluția de colorant. Există și alte căi: în cavitatea corpului (toracic, abdominal) injectat colorant, în care a pictat in principal elementele neuronale ale membranelor seroase, și apoi (când albastru de metilen merge în sânge) și alte organe. Colorantul este injectat direct în țesutul corpului de testare. Primele două metode sunt mult mai probabil.
Eutanasierea animalului cu ajutorul anesteziei, este necesar pentru a expune un vas arterial majore cel mai apropiat de corp, elementele neuronale care sunt colorate. De exemplu, pentru a detecta elementele neuronale ale membrelor inferioare, expunând aortei abdominale oarecum deasupra bifurcației acesteia, în regiunea capului de injectare - .. Artera carotida in gat, etc. La animale mici (șobolani, porci de guineea, iepuri, pisoi) canulei a fost introdus direct în aorta . Nava a fost a lua pe o ligatură în jurul locului de injectare (mai aproape de inimă) și ligat. Vasul este o incizie inserată în canula are dimensiunea corespunzătoare și să consolideze ligatura acesteia. Un tub de cauciuc (echipat cu un clip) o canulă conectată la vasul în care se toarnă lichidul Ringel-Locke, încălzit la o temperatură de 37 ° C Înainte de a intra în canula, este necesar, folosind o clemă, pentru a umple întregul tub fluid și canulă. Recipient cu lichid Ringer - Locke consolida aproximativ 70 cm deasupra nivelului canulei, clema deschisă și a trecut la rezervorul de lichid de spălare. Dacă o astfel de instalație de spălare (și introducerea ulterioară a colorantului) imposibil de colectat, Ringer - Locke și albastru de metilen poate fi administrat într-un vas de seringă, un tub de cauciuc se conectează la canulă.
Astfel, după spălare și injectat soluție de albastru de metilen, se încălzește la temperatura corpului animalului (la rata de soluție 15 ml 1% de albastru de metilen în 1 litru de lichid Ringer - Locke). colorant timpul de injecție trebuie să fie determinată în mod empiric. În acest scop, bucăți de regiune injectabile țesut intercalată între două lamele și sub o mărire redusă a controla cursul vopsirii elementelor neuronale. De obicei, culoarea nu depășește 40-50 de minute. După injectarea este completă, corpul este deschis și lăsat timp de 2-3 minute în aer (în prezența oxigenului este îmbunătățită celulele nervoase pata).
Apoi bucățile mici de organe excizată și plasată într-un termostat la 37 ° C pentru contramarcate. În acest scop, pe fundul cupei a fost plasată o hârtie de filtru umezită cu aceeași soluție de colorant, care este utilizat pentru injectare, iar suprafața obiectului prin soluția colorantă este aplicată în picături. Ținând o bucată mică a corpului între cele două cadre, controlează cursul colorării sub microscop.
Puteți face de colorat prin cufundarea corpului în colorant. Această metodă este deseori folosită atunci când se lucrează cu corpuri subțiri, cum ar fi pereții organelor interne goale. corpul piesei este tăiat, îndrepta, a pus | într-un vas Petri pe hârtie de filtru și apoi se toarnă o soluție de albastru de metilen în Ringer de fluid - Locke. Și pentru a monitoriza progresele înregistrate de colorare sub microscop.

Fixation și concluzie

După colorare cu albastru de metilen trebuie să capteze imediat obiectul, de aceea este important să se pregătească în avans și fluid la frigider reținere. Fixarea se realizează la o temperatură de 1-3 ° C fixarea timpului depinde de dimensiunea obiectului. Pentru filme subțiri, timpul de fixare a soluției molibdat de amoniu este de 30 min - 1 oră, o soluție de picrat de amoniu -. Obiecte 3.2 h Thicker fix 12-24 ore.
În unele cazuri, utilizați o dublă blocare: timp de 30-40 minute fix soluție picrat de amoniu, și apoi transferat la 1 zi în soluția de molibdat de amoniu.
După fixare, piesele trebuie clătite bine cu apă distilată, care este înlocuit de 5-6 ori pentru a îndepărta cristalele de sare de fixare. Ei au fost apoi transportate rapid prin 96 ° și alcool absolut, xilen și încorporate în balsamul. Dacă doriți să gătesc felii, apoi se toarnă în celloidin. umplere cu parafină este posibilă numai când Fixing secvențială descrisă mai sus ambele săruri. Preparate membranoase și secțiuni pot fi dokrasit orice colorant nuclear, cum ar fi alaun carmin. Elementele neuronale Blued sunt în mod clar vizibile pe fundalul celulelor din jur ale căror nuclee sunt colorate în roșu.
Stăpânirea tehnici supravital colorant albastru de metilen este, de asemenea, cel mai bine pentru a începe cu astfel de obiecte, care identifică elemente neuronale cel mai simplu si pointedly.
În acest sens, putem recomanda ganglionul intestinale a animalelor de laborator smenki (gestiona cele mai bune celule nervoase de colorare a câinilor și pisicilor tinere).