Medii de cultură - microbiologie cu tehnica testelor microbiologice

Pentru rezolvarea problemelor de bază examenului bacteriologic (izolarea culturilor pure de bacterii, determinarea proprietăților lor biologice, și așa mai departe. D.) Ar trebui să fie în măsură să crească microorganisme în laborator. Acest lucru se face în mediile nutritive. mediu nutritiv corespunzător fierte determină succesul unui microbiolog de laborator.
Compoziția mediilor de cultură ar trebui să includă:

1. Substanțe necesare pentru creștere și reproducere, precum și pentru construcția celulei bacteriene: sursele de azot, carbon, oxigen și hidrogen.
2. Compusul anorganic sub formă de diferite săruri.
3. vitamine bacteriene, sau așa-numitele factori de creștere.

In plus, mediul nutritiv trebuie să aibă o anumită viscozitate, umiditatea și mediul de reacție. Microbii se adapteze la unele variații ale acestei reacții, dar pentru fiecare microb sunt limite dincolo de care aceste fluctuații nu ar trebui să procedeze.
În practica microbiologică, există multe varietate de medii de cultură. În funcție de proprietățile lor, compoziția și destinația medii de cultură pot fi împărțite în mai multe grupuri.
De origine disting: a) medii de cultură naturală și b) medii de cultură artificiale.
Primul grup include ser, bilă, ouă, lapte, cartofi, morcovi. Al doilea grup - mediul de creștere preparate din carne sau legume tincturi, la care se adaugă diverse produse azotate, carbohidrați și săruri, cum ar fi carne-peptonă, carne-peptonă agar, etc ...
Consistența mediului este separat într-un lichid și solid, semi-solid. La mediul dens se referă carne-peptonă agar nutritiv gelatină, zer pliată, laminată proteina din ou, cartofi, etc .. mediu de cultură semifluide este de 0,5% carne-peptonă agar. Se referă la un bulion lichid mediu de carne-peptonă, apă peptonată, bulion de zahăr și altele.
În componența tuturor mediile de cultură pot fi împărțite în trei grupe:

1. mediu bazic, sau simplu, utilizat pentru cultivarea majorității microbi patogeni (carne-peptonă, carne-peptonă agar, carne-peptonă gelatină și colab.);
2. mediu special, sau electivă, utilizate pentru izolarea și cultivarea anumitor bacterii patogene, care în medii obișnuite slab sau nu cresc (bulion de zahăr, agar cu sânge bulion colic și altele.);
3. Differential-diagnostic mediu, servind drept unul dintre mijloacele auxiliare de determinare (identificare) a unei culturi pure a microorganismului testat (număr carbohidrați pestriț Hiss, agar Endo și colab.).

Video: Medii de cultura pentru microbiologie medicală. Partea a 2.

Pregătirea mediilor de cultură

Principalele medii de cultură

Cel mai comun mediu lichid este un bulion de carne-peptonă. El se pregătește să măcelărească apa.
apa din carne. tocata carne, eliberat de grăsime și de tendon, au fost amestecate în greutate, cu dublul cantității de apă (500 g apă + 1 L), insista 24 ore la temperatura camerei, se filtrează printr-o bucată de pânză și carne complet drenate rămas pe ea. apa Carnea este o reacție acidă lichid roșiatic. Conține substanța solubilă de proteine ​​(albumina), extractibile și puțină sare. Carnea se fierbe apa pana la plierea proteinelor și se filtrează prin hârtie de filtru. Pentru a economisi apa, carnea este turnată în fiole sau flacoane și sterilizate într-o autoclavă la 120 ° timp de 20 de minute (vezi. P. 74). În prezent, o metodă utilizată pe scară largă umplutură de extracție, la cald, fără înmuiere în apă rece. Carne tocată cu apă încălzită de 1/2 h, fără fierbere, și apoi se fierbe timp de 1 oră. Această metodă este cel mai bine sa bucurat în timpul verii.
Prepararea bulionului de carne-peptonă. bulion de carne este preparată din apă, la care substante nutritive pentru a îmbunătăți proprietățile adăugat peptonă (1%) și clorură de sodiu (0,5%), m. E. La 1 litru de carne ia apă 10 g peptonă și 5 g de clorură de sodiu. Amestecul a fost refluxat timp de 10-15 minute, cu agitare constantă. Astfel, peptonă și sare dizolvată. Bulionul rezultată este acidă la care microbii patogeni mai împiedică creșterea. Prin urmare, este necesar să se facă reacția ușor alcalin.
Pentru a stabili reacția trebuie să aibă o soluție indicatoare și soluții titrate de baze și acizi. In Bacteriologie folosesc diverși indicatori, adică o substanță a cărei culoare variază în funcție de mediul de reacție, cum ar fi de turnesol, fenolftaleină, m-nitrofenol, p-nitrofenol, etc. turnesol cel mai des utilizate sub formă de hârtie de turnesol, fenolftaleina -... A 0 , soluție 5% alcool metanitrofenol- soluție 0,3% apoasă (apă distilată) și para-nitrofenol - ca o soluție 0,1%, acizi și baze apoase - ca și soluții normale. După ce a fost fiert stabilirea bulionului de reacție, se filtrează și se sterilizează.
Stabilirea mediului nutritiv al reacției. In prezent, o metodă frecvent utilizată pentru determinarea mediului de reacție este o metodă colorimetrică Michaelis. Esența metodei se bazează pe modificarea culorii indicatorului în funcție de gradul de disociere. Acest lucru este cauzat de concentrația de ioni de hidrogen a lichidului de probă.
pH neutru corespunde pH-ului 7,0-<7,0 обозначает кислую реакцию, рН>7,0 — щелочную реакцию. Для колориметрического метода нужно иметь наготове большее количество различных кислых и щелочных растворов, активная реакция которых (pH) заранее определена электрометрическим путем. Эти стандартные растворы должны быть подобраны так, чтобы получилась целая шкала с постепенно нарастающей щелочностью (pH): 5,0- 5,2- 5,4- 5,6 и т. д. Обычно Для определения pH пользуются стандартными растворами в запаянных пробирках, которые установлены рядами в специальном ящике с крышкой.

Fig. 22. Michaelis comparator (explicații în text).

Pentru a determina pH-ul, utilizați un comparator, care este un bloc de lemn pe suprafața superioară care are găuri b (3 în două rânduri) de aceeași mărime ca și tuburile utilizate. Eprubete pentru jumătate din lungimea sa sunt incluse în unitate ca un trepied obișnuit. Comparator suprafețele laterale netede și peretele din față și din spate sunt prin găuri prin care lumina trece. Pe peretele din spate al găurilor sunt introduse mat (lapte) și albastru de sticlă (Fig. 22).
Determinarea mediului de cultură de reacție este după cum urmează. Deschiderea 2 a tubului introdus comparator cu 2 ml de mediu nutritiv la care se adaugă 4 ml de apă distilată și indicator de 1 ml (meta- sau para-nitrofenol) în gaura 5 - tubul care conține apă distilată. În otverstvija 1 și 3 inserat în flacoane conținând 2 ml din același mediu nutritiv cu 5 ml apă distilată (fără indicator). Găurile 4 și 6 pentru a da tuburile standard cu astfel de parametri pH, între care se dorește să creeze un mediu de reacție. În a 2 sau tuburile 1 sau 2 și 3 atunci când este văzut în lumina transmisă prin deschiderile din pereții laterali ai comparatorului ar trebui să obține exact aceleași nuanțe de lichide de culoare. mediul de reacție corespunde reacției standard, cu care coincide în culori. Dacă culoarea va fi mai ușoară în eprubetă 2a decât standardul, atunci acesta se adaugă, prin picurare, decisivã
soluție alcalină normală până colorație nu devine egală cu standardul. Apoi, cantitatea calculată de alcalii a fost necesară pentru a stabili reacția 1 l de mediu, pe baza cantității de alcalii, adăugat.În la 2 ml de bulion.
Exemplu. Trebuie să fie setat la pH 7,4 mediu de testare. Găurile 4 și 6 se introduce într-un tub standard, cu denumire de pH 7,4 și 7,6. Tubul a fost introdus în gaura de 2, se toarnă în picături dintr-o soluție de hidroxid de sodiu gradat pipetă decinormal până la până la o nuanță corespunzătoare standardului cu pH-ul dorit. Dacă pentru stabilirea pH-ului în 2 ml de mediu a luat 0,2 ml de soluție de hidroxid de sodiu decinormal, apoi la 1 L necesară 0,2 X500 = 100 decinormal ml sau 10 ml soluție normală de hidroxid de sodiu. Deoarece sterilizarea mediu pH-ul este adesea modificat pentru a reduce alcalinitatea înainte de sterilizare trebuie stabilită ușor peste pH-ul dorit (0,2). mediu nutritiv solid topit, înainte de determinarea pH-ului. Determinarea se efectuează așa cum este descris mai sus.
Recent a lansat pentru dispozitivul vânzare Michaelis pentru determinarea pH-ul micrometodei mediu.
Prepararea agarul carne-peptonă. Pentru carne-peptonă bulion se adaugă la 2 la 4% (în funcție de soi) tocate agar-agar și se încălzește până la dizolvarea completă. Apoi a fost lăsat să se răcească la 50 ° și se adaugă la iluminarea albușul de ou (1 l agar ia agitat și se amestecă apa cu o cantitate mică de proteine ​​de ou), agitat bine și plasat timp de 4-5 minute într-o autoclavă. Proteinele coagulează în timpul fierberii și antrenând particulele în suspensie. Lichidul rezultat tulbure se filtrează fierbinte prin bumbac îmbibat cu apă fierbinte. Puteți face fără alb de ou, dar agar obținut destul de luminat. Filtrat agar fierbinte distribuit în eprubete, în 5 până la 8 ml în flacoane sau 50-500 ml și autoclavizat timp de 20 minute la 120-125 °. După sterilizare, tubul de testare cu agar lichid trebuie să fie pus aproape orizontal la agar înclinate înghețate în poziție cu o suprafață mare, sau da-l să se solidifice sub forma unei coloane. În primul caz se va teșite. agar, în al doilea - o coloană (fig. 23). Slant ar trebui să fie în partea de jos a apei de condensare tuburilor necesare pentru funcționarea normală a microbilor.

Fig. 23. Tuburi cu agar agar și înclinate pe coloană.

M I o-peptonă gelatină. La 1 litru de apă de carne se adaugă 1 g de peptonă, 5 g de clorură de sodiu și 100 sau 150 g de gelatină fin tocat. Se lasă să stea timp de câteva ore la gelatină umflate. Amestecul rezultat a fost încălzit până la dizolvarea completă a gelatinei. Este setat reacție slab alcalină, iluminarea albusul, se filtrează prin vată, înmuiate în apă clocotită. După turnare, mediul este sterilizat în aparatul Koch 3 zile, timp de 60 minute în fiecare zi. gelatina nu pot fi sterilizate într-o autoclavă, deoarece isi pierde capacitatea sa de a se intareasca. Gelatina se topește la 23-25 ​​° C și din nou se solidifica la o temperatură sub 22 °.

Substante nutritive pentru a digera Hottinger. Soluția de bază Hottinger înlocui cu succes apa de carne. Se prepară după cum urmează. Se taie în bucăți mici 1 kg de carne, este plasată într-un vas care conține 1,5 litri de apă la fierbere și se fierbe timp de 15-20 minute. Carnea este apoi prins și zdrobit într-o mașină de tocat carne. Lichidul răcit la 40-45 ° și se toarnă într-un flacon se adaugă 1,5 g de sodă, 3-5 g de pancreatină și 15-20 g de cloroform, imediat închis cu un dop de cauciuc și agitat. La acest lichid se adaugă carne tocată, bilă (20 ml bilă per 1 kg de carne tocată), agitat și lăsat sticla să stea la temperatura camerei timp de 5 zile sau mai mult (lichidul din flacon în fiecare zi, de mai multe ori pe zi, cu agitare) până când conținutul circumvoluțiunilor sale în , lichid galben transparent profund cu sedimente fine pe fund. Suficiență reacție de digestie se determină la triptofan. Apoi lichidul filtrat este turnat în fiole și sterilizate prin autoclavare la 120 ° C, timp de 20 de minute. Pentru prepararea unei Bouillon această soluție stoc este diluată cu apă distilată de 3-5 ori sau 10. Cantitatea de diluare depinde de scopul pentru care acest mediu este destinat microorganismelor, iar calitatea soluției rezultate Hottinger. Pentru a digera HOTTINGER deja divorțați adăugat 0,7% clorură de sodiu și 0,1 g / fosfat de potasiu v (K2HPO4), fierte, setați reacția dorită din nou refluxată, se filtrează printr-un filtru de hârtie, din nou, verificați reacția este turnată în eprubete și flacoane și sterilizate într-o autoclavă la 120 ° C, timp de 20 de minute.
Dizolvarea într-un agar bulion sau gelatină pentru a se obține un mediu solid adecvat.
Pepto Martin și bulionul de la ea. Ia piept de porc, fără grăsime și, fără a se spăla, a trecut printr-o mașină de tocat carne. Umplutură coborât într-o sticlă de 250 g și se toarnă soluție de acid clorhidric (1 L încălzit la 50 ° robinet de apă + 10 ml de acid clorhidric fumans). Amestecul a fost lăsat să se digera într-un termostat la 45-50 ° până tocată încă transformată în masă sub formă de pudră și nu vor apărea reacții pozitive la triptofan. Digestia dureaza de obicei 48 de ore. Astfel obținut peptonă vatra a fost sterilizat în flacoane la aceeași presiune de 1 atm (peste normal).
Pentru prepararea bulionului Martin sticla aspirat sifon lichid sau pipetă Mora capacitate mare, filtrată prin bumbac și se adaugă un volum egal de carne de apă. Apoi instalați supa de reacție necesară a fost fiert timp de 30 minute, lăsat să se așeze și apoi se filtrează printr-o pânză sau hârtie de filtru, este distribuit în eprubete și flacoane și în final sterilizate la o presiune de 0,5 atm timp de 30-40 minute.

Medii de cultură speciale

agar Zahăr și bulion de zahăr se prepară prin adăugarea la bulion sau un adaos convențional topit agar simplu dintr-un carbohidrat într-o cantitate de la 0,5 până la 1%. Carbohidratul a fost dizolvat într-o cantitate mică de apă și apoi se adaugă la mediul nutritiv. Sterilizarea bulion de zahăr și agar se efectuează în unitatea de Koch 3 zile la rând timp de 1 oră.
Agar cu lichid din sânge, ser sau ascitic a fost preparat sub asepsie strictă. Pentru gata slab alcalin topit și răcit din nou la 45 ° agar dispensat în eprubete sau flacoane, se adaugă 20-25% ser steril sau fluid ascitic sau 5-25% din sânge defibrinat steril. După amestecare completă (pentru a se evita formarea de bule și spumă) agar în tuburi este cosite și conținutul turnat în fiole Geidenreich cupe.
Bulion cu ser, fluid ascitic, sau sânge preparate în același mod ca și agar, dar fără încălzire. Pentru a monitoriza bulion sterilitate plasat într-un termostat, timp de 48 ore la temperatura de 37 °.
Miercuri Leffler. Serul obținut din sângele unui cal, un taur sau un berbec. Trei părți din serul obținut se amestecă cu o parte dintr-un bulion de zahăr slab alcalin (1% peptonă, clorură de sodiu 0,5% și 1% glucoză) și dozate pentru a testa tuburi la 8 ml. Tuburile au fost plasate într-un aparat special pentru coagulare într-o poziție înclinată și se încălzește timp de 1 oră la 80-90 ° timp de 3 zile. În acest caz, serul coagulează. Pentru a monitoriza tuburile de testare de sterilitate puse timp de 48 de ore într-un termostat la 37 °. În același mod se prepară din tuburi laminate din ser de cal, bulion nediluat (Medium Ru). Încălzirea trebuie să se facă încet pentru a evita formarea de bule. Miercuri folosit pentru a evidenția bacili difteria.
mediu de diagnostic diferențial.
Miercuri Endo. Se obține imediat înainte de utilizare. K SO ml agar carne-peptona sau bulion Hottinger agar (pH 7,6), se adaugă 1 g de steril lactozei chimic pure, dizolvate în 5 ml de apă sterilă, se răcește la 70 ° C și amestecul s-a adăugat 0,5 ml dintr-o soluție saturată de fucsină de bază și 1 25 ml dintr-o soluție proaspăt preparată 10% de sulfit de sodiu, se agită și se toarnă în pahare. Pentru uscarea unui recipient deschis a fost plasat timp de 30 minute într-un termostat la 37 ° C.
Miercuri Endo Coloniile de E. coli dă o culoare roșie, cu o tentă metalică, iar bacteriile tifoide-germen și de grup dizenterie - colonii incolore (a se vedea figura 77 din insert ..).
Numărul Motley de carbohidrați (Hiss miercuri). K SO ml de apă se adaugă 1 g de peptonă, 0,5 g de sare de masă. Peptonă și sare dizolvată în apă fierbinte timp de câteva minute și se filtrează printr-o hârtie de filtru (soluția trebuie să fie complet transparent). PH 7,0 ajustat. In acest mediu au fost dizolvate 1% dintr-un carbohidrat aplicat pe partea inferioară a tuburilor este coborâtă plutitor pentru captarea gazului (doveditor clivarea zaharuri adânci) și indicator adăugat. În timpul utilizării ca indicator:
a) tinctura de turnesol - 5 ml per 100 ml mediu. In acid tinctura de turnesol mediu prezintă roșeață, alcalină - posinenie- b) azolitmin, care este un preparat purificat de turnesol, sarea sa de potasiu (în 1 litru de mediu a fost adăugat 0,25 g azolitmina) - c) bromtimolblau - pentru 1 litru de mediu 1 ml soluție alcoolică 1,6% dintr-un indicator (mediul devine verde, albastru în formarea alcaline îngălbenește sub formarea acidului) - g) indicator Andred care este compus din 1 g de fucsin de acid, 400 ml apă distilată și 64 ml dintr-o soluție normală de hidroxid de sodiu. La mediul a fost adăugat indicator 1%. Mediul în tubul trebuie să achiziționeze o culoare galben-pai, cu nici o culoare roz. În mediul acid al culorii mediului a fost schimbat la roșu (Fig. 24 insert).
Indicator adăugat la mediul de cultură pentru a determina modificările reacției care au loc sub influența fermentarea carbohidraților, t. E. Pentru detectarea activității biochimice microbiene. Acesta din urmă este important pentru diagnosticul microbiologic al unui număr de boli infecțioase (febră tifoidă, dizenteria, holera etc.). Medium cu indicator carbohidrații și distribuită în fiole sterile și sterilizate prin fracțională la 100 ° timp de 3 zile.

Video: apa culturi pe microbi

Medii de cultură uscată

Folosirea mediu nutritiv uscat devine mai practic. Standardizarea, ușurința de depozitare, de transport și de fabricare a face mediile nutritive uscat este foarte confortabil de a lucra cu.
Medii de cultură uscată sunt higroscopică galben pal fără cocoloașe cu umiditate de până la 10%. Într-un loc uscat, într-un vas bine sigilat poate fi depozitat pentru o perioadă lungă de timp. Acestea trebuie să fie bine dizolvat în apă distilată la temperatura camerei, la o concentrație de 1,5-6%.
bulion nutritiv uscat. 25 g din pulberea a fost dizolvată în 1 litru de apă distilată rece în timp ce încălzirea, distribuite și sterilizate. După sterilizare la 120 ° timp de 15 până la 20 de minute pentru a da o soluție limpede, fără sediment-culoare galben pal, cu un pH neutru. Din bulion nutritiv uscat poate fi gătit în bulion carbohidrați diferențiale mediu, agar nutritiv și mediu diferential solid.
agar nutritiv uscat. Pentru a adăugat 1 litru de apă distilată 50 g din pulberea este topită, reacția dorită reglată este trecut printr-un filtru de bumbac-tifon, îmbuteliat și sterilizate la 120 ° C timp de 25-30 minute.
Uscat agar Endo. 5 g de pulbere de culori lavanda pal (perisabil fascicul influențat) se toarnă în 100 ml apă distilată rece și apoi se topește și se fierbe timp de 5 minute. După răcire la 50 ° masă agitată (pentru distribuirea uniformă a precipitat) și distribuit într-o ceașcă.
medie Hiss cu carbohidrați și indicatori BP.

1 g de pulbere se toarnă în 100 ml apă distilată rece, încălzite pentru a se dizolva, distribuite în tuburi sterile cu flotoare și sterilizate timp de 5 minute la 110 ° C (conform manualului). A fost lansat și a doua modificare a mediului - un semi-fluid (fara deversând pluteste). Mediu după sterilizare și răcire au o culoare roz-gălbui roz sau pal. Mediul lichid este transparent, semi-lichid cu opalescent. Indicator BP este un amestec de cerneală cyan și acid rozolovoy apă. În mediul acid al indicatorului are o culoare albastru intens în alcalină - de la ușor roz la roșu.

bilă uscată. 7 g din pulberea a fost dizolvată în 100 ml de apă se toarnă, se sterilizează prin autoclavare. Utilizați suporturi de izolare ca îmbogățire cu bacterii din sângele de febră tifoidă și germen.
mediu uscat Leffler. 100 g din pulberea se triturează într-un mojar cu o cantitate mică de apă caldă pentru a obține o masă omogenă, a fost adăugată apă caldă până la 1 litru, filtrat prin două straturi de tifon, eliberate în eprubete și sterilizate în Convolutors Koch timp de 3 zile la 90 ° timp de 1 oră.
Indicator de zer BP. 1 g de pulbere de culoare lavanda gri se toarnă în 100 ml de apă distilată rece se toarnă în eprubete și sterilizate cu abur care curge timp de 20 de minute. Miercuri culoare ametist. Bastoane tifoidă și dizenterie nu se schimba culoarea mediului. Odată cu creșterea de E. coli miercuri devine brusc albastru. Bacteria pătate germen albastru mediu.

Filtrarea și turnarea de medii nutritive

medii nutritive lichide și gelatina topită este filtrată printr-un filtru sau hârtie de filtru cutată, umezit în prealabil cu apă, sau prin pânză de filtrare, aplicată într-o pâlnie de sticlă. Filtre de lenjerie de uz practic, deoarece acestea pot servi pentru o lungă perioadă de timp, în timp ce filtrele de hârtie sunt folosite doar o singură dată. media Filtrarea agar angajat filtru de bumbac-tifon. Agar este turnat pe filtru fierbinte. După filtrare, mediul de cultură este turnată în vase (sticle, eprubete).
Turnarea un tub de mediu nutritiv sunt pâlnie sau biurete la capătul inferior al care este montat un tub de cauciuc scurt, cu un cap mic și un pahar-clemă Mora.

Video: Cultivarea microbi - Elizabeth Bonch- Osmolovskaya