Utilizarea metodelor spectroscopice de analiză - biomaterialovedenie - polimeri scop medical

Printre metodele de analiză instrumentală folosind metode fizico-chimice [26], spectroscopie un rol deosebit de important. In domeniul biochimiei, inclusiv analiza clinica, IR utilizate în mod obișnuit și studiul spectroscopie UV a spectrului vizibil, analiza fluorografie, spectroscopie Raman cu laser, spectroscopie de rotație precipitare, dicroismul circular, spectroscopie RMN, spectroscopie de electroni de spin rezonanță și alte metode de analiză. Tot ceea ce au practicat cu succes în mikrokolichestvennogo, calitatea și determinarea structurală a diferitelor substanțe cu masă moleculară mare, cum ar fi proteine ​​și acizi nucleici în soluție și în celelalte stări de agregare.

spectroscopie de reflexie IR

Principiile generale, metodele și scopul spectroscopiei IR sunt bine cunoscute, iar autorul se referă cititorul la literatura de specialitate pe această temă [26, 27, 28].

Figura 71. Schema spectroscopie de reflexie în infraroșu prin schema (ATR). A - un mediu cu un indice ridicat de refracție (prism ATR) - Bytes - proba (film polimeric).
Fig. Schema suport de prismă 72. spectrograf IR funcționează conform metodei ATR.
1 - 2 susținere plastina- - etanșare prokladka- 3 - proba la un semifabricat în formă de 4 - reglare vint- 5 - Șurub de fixare.
Aici este recomandabil să se menționeze doar un aspect particular al metodei spectroscopiei de reflexie (ATR). Principiul punerii sale în aplicare se caracterizează prin diagrama din Fig. 71- spectrograf parte de lucru care funcționează pe principiul ATR, este prezentată în Fig. 72.
O prismă pentru crearea reflexii sunt de obicei realizate dintr-un material care este transparent și are un indice de refracție ridicat în lungimile de undă măsurate (n) decât polimerul analizat. Un astfel de material (KRS) constă dintr-un amestec de cristale T1i-T1Vg (la 4 mm, n = 2,38), AgCl (x =) 2,00, Ge (x = 4.10) și unele alte componente. O prisme reflectorizante prinse strâns între suprafețele eșantioanelor în formă de polimer plenok- dacă unghiul de incidență depășește valoarea critică, adică. E. 0 C = = sin_1, este generat reflexie totală. Determinarea absorbției fasciculului reflectat asigură o porțiune de suprafață a spectrului IR al eșantionului (adâncimea de același ordin ca și lungimea de undă a fasciculului incident de lungime de undă). Astfel, folosind spectroscopia specifică caracteristica de reflexie poate determina substanța depusă pe suprafața polimerului în studiu, în special proteinele adsorbit pe acesta.
Lyman și colab. [29] spectroscopie de reflexie IR a fost utilizat pentru cuantificarea adsorbția proteinelor plasmatice pe peliculele de polimeri diferiți. Metoda dictată de necesitatea de a preveni contactul cu suprafața filmului probei sub gaz și faze lichide. Mai întâi, proba de film a fost îmbibat în apă distilată, apoi s-a adăugat la soluția de proteină și se incubează timp de 2 ore la 37 ° C, și apoi se spală cu apă distilată și se lasă să stea peste noapte la o temperatură de 50 ° C sau liofilizate. Numai după un astfel de tratament probele au fost supuse la ATR spectroscopie în infraroșu. Concentrația de proteină (mg / cm2) adsorbit pe suprafața probei a fost cuantificată prin absorbanța a benzii de absorbție caracteristică (la 1640 cm-1) amidă I, t. e. bandă caracteristică proteinelor. Ca un standard utilizat atunci când se măsoară extincția benzilor caracteristice ale diferitelor probe (de exemplu, polidimetilsiloxan și polietilenă, care sunt, respectiv, la 1410 și 1460 cm-1). schiță spectrale obținute prin acest procedeu sunt prezentate în Fig. 73.
Astfel, sa găsit o corelație între concentrația soluției de proteină și adsorbția acesteia din urmă pe suprafața materialului polimeric. Acesta este descris de izoterma de adsorbție prezentat în Fig. 74. Din echilibrul poate determina curba concentrației de proteină adsorbită pe suprafața substanței moleculară ridicată. Pornind de la parametrul obținut se poate calcula o grosime a stratului de suprafață adsorbit proteină adsorbție medie pe fiecare moleculă de proteină și alte caracteristici. Rezultatele acestor calcule la 37 ° C sunt prezentate în Tabelul. 43.
Lyman și colab. [29] considerate date tabulare în combinație cu parametrii care descriu mărimea și configurația moleculelor ale proteinelor plasmatice. Acești parametri au fost determinați în '40 Oncley [30] - acestea sunt prezentate în tabelul. 44.
Supravegherea Lyman poate fi redusă la următoarele dispoziții de bază:

1. Adsorbția proteinei la polimer hidrofob se termină în principal într-un strat monomolecular;

1. Adsorbtia nu are loc în lateral (laterale), și de către un terminal grupe (end-on);

Fig. 73. în infraroșu Spectrul de absorbție al albuminei (plasma umană) adsorbit pe suprafața filmului de polietilenă [29] (folosind ATR).

1. - polietilenă înainte de contactul;
2. - după contactul cu soluția de proteină.

Fig. 74. Adsorbția gamma-globulină pe suprafața unui film din polistiren (la 37 ° C).

1. prin toate indicațiile, conformația Denaturarea proteinelor adsorbite nu suferă modificări semnificative. Toate cele de mai sus pot fi rezumate în sensul că, în procesul de tromboză rolul de denaturarea proteinei schimbării este foarte mică.

Tabelul 43. Adsorbția proteinelor plasmatice pe suprafața unor materiale polimerice (la 37 ° C)

Tabelul 44. Mărimea și configurația proteinelor plasmatice molecule [30]

De un interes considerabil este lucrarea lui Lee și Kim, care a fost utilizat pentru ATR metoda spectroscopiei în infraroșu pentru a studia corelația dintre polimer și adsorbția proteinelor debitului sanguin [31]. Curba construită de adsorbție albuminei pe suprafața poliuretan segmentat (copolimer de eter cu uretan și uree), în diferite condiții cinetice sunt prezentate în Fig. 75. Din aceste curbe rezultă că mai mare rata fluxului sanguin, cu atât mai dificilă starea de sorbție echilibru este atins, cu alte cuvinte, mai repede sângele, mai lent adsorbția proteinelor pe suprafața polimerului. Astfel, în ceea ce privește absorbția de proteine ​​și trombogenezei rol de viteza fluxului de sange este extrem de mare.
Toate acestea sugerează că calitatea generală a cercetării în domeniul proteinelor de adsorbție spectroscopiei IR polimeri medicale prin metoda ATR este acceptabilă. Acest lucru este confirmat de spectre, demonstrate în 1976 la Simpozionul VI privind utilizarea polimerilor în medicină [32] - acestea sunt prezentate în Fig. 76. Cu toate acestea, există o serie de probleme și dificultăți în acest domeniu, care încă mai trebuie rezolvate. Următoarele probleme se referă la ele.

1. Conform benzilor caracteristice ale polipeptidelor pot fi identificate prin structura lor (tab. 45). Cu toate acestea, rezultatele spectroscopiei IR ATR, strict vorbind, nu coincid sau, în orice caz, nu este complet în concordanță cu poziția și configurația benzilor de absorbție din spectrul de transmisie. În plus, este practic imposibil să se realizeze și să împartă în mod clar banda amidic I în detaliu, astfel încât este dificil, folosind metoda ATR, diferențiază diferitele componente ale proteinelor cu un grad satisfăcător de rezoluție. În final, crește și aplicarea devine imposibilă metoda ATR în regiunea de joasă frecvență a spectrului (de exemplu, în domeniul amidic V) IR lungime de undă.

1 - un silicon cauciuc neumplut-2 - poliftorviniliden- 3 - 4 polietilenă - bloc copolimer polimetilmetacrilat cu polivinil atsetatom- 5 - kuprofan- 6 - polietilen tereftalat.

Fig. 76. Spectrele IR ale unor polimeri, caracterizarea proteinei de adsorbție
contactul cu sângele (eliminat metoda ATR).

Fig. 75. Dependența Albumină de adsorbție pe suprafața poliuretan segmentat a debitului sanguin [31].
1 - 0 ml / c 2 - 3 ml / C 3 - 6 ml / c- 4-9 ml / c este 5-12 ml / s.
Curbele rupte - înainte de contactul cu sângele, și solidul - după contactul.
Fig. Spectrele 77. IR din nailon 6 probe luate metoda ATR.

A - proba B, - după contactul cu B krovyu- - după 1 h, B - după 24 de ore.
Astfel, pentru studiile structurale fine și identificarea acestei metode atunci când este utilizat în monoterapie nu este potrivit.

1. În funcție de densitatea și gradul de contact al comprimării probei și prisme mikrootkloneniya apar la nivelul de dispariție, astfel încât determinarea cantitativă a proteinelor metodei ATR este extrem de dificilă.
2. banda de absorbție 3600-2500 cm -1, 1700-1400 cm-1 și 900-500 cm-1, care pot fi atribuite apei, sunt suprapuse pe benzile de amidă având în vedere ceea ce este necesar pentru a elimina apa din măsurătorile. În acest sens, sa raportat că instalarea transformatelor Fourier nou dezvoltate poate rezolva această problemă.
3. Funcționarea îndepărtării apei (uscarea convențională sau uscare prin congelare) sunt pline de pericolul de denaturare a adsorbită proteine.
4. Când este utilizat ca un polimer conținând proba cum ar fi nylon, grupări amidice, IR ATR metoda spectroscopiei este imposibilă datorită interferenței caracteristică benzilor de absorbție (cm. Spectra în fig. 77).

spectroscopie UV

Pentru analiza cantitativă a proteinelor prin spectroscopie UV următoarele benzi-cheie sunt utilizate: a) absorbția în regiunea 250-313 nm, cu un maxim de absorbție la 280 este cauzat resturile LMW de aminoacizi aromatici, de exemplu, triptofan, tirozină sau fenilalanina-
b) banda de absorbție la 225-215 nm atribuibil
legătură peptidică (CONH -) -
c) banda în intervalul 194-191 nm, care este menționată ca pre
cedând la legătura peptidică.
Nyilas și colab. [33] a introdus în gamma Bulina soluție micropowder sticlă, un amestec de diametru sferulite 12,5-40,5 mm, cu o granulație de ordinul micronilor și mai jos. Mai departe definit pe monitor (extincție la 278 nm), concentrația de proteină în partea superioară a lichidului transparent și pentru a reduce concentrația de adsorbție proteină interpolată. Primit izotermei de adsorbție la care sa calculat că valoarea y-globulină este adsorbit pe suprafața de sticlă ca un strat monomolecular, măsurată prin cantitatea de ordinul a 0,12 g / cm2, iar suprafața medie a adsorbției atribuită fiecărui macromoleculă proteinei atinge 2180 nm. Evident (și acest lucru este confirmat de tabel. 44), că această suprafață mai mare decât cea care ar fi ocupat de la terminalul de adsorbție (de final pe circuit) sau pe laterale (laterale circuit) grupuri. Pentru toate spațiile, nu exclude posibilitatea ca schimbarea de adsorbție conformație globulina. Trebuie remarcat faptul că această concluzie nu este coincide în totalitate cu concluziile formulate pe baza spectroscopiei IR Lyman ATR. Necesită în continuare în profunzime de cercetare în acest domeniu, pentru a răspunde la această întrebare în mod clar.