Colorat - microbiologie cu tehnica testelor microbiologice

Pentru colorarea bacteriile trebuie să aibă un număr de soluții de coloranți, de preferință, în flacoane speciale cu pipete, care purtau cutii de cauciuc. Vopsea cu o pipetă se toarnă pe droguri, astfel încât întregul frotiul a fost acoperit cu ea. Prepararea vopselei este plasat pe diapozitive standului. O astfel de poziție este plasată pe o cupă sau o tavă fotografică (Fig. 14). Dacă colorația este necesară încălzirea, apoi utilizați pensete speciale să alunece (Fig. 15). La încetarea colorării colorantului cu jet de apă de spălare sau de droguri în vas se spală cu apă. După preparare de spălare este lăsată într-o poziție verticală pentru uscare sau uscat între foi de hârtie de filtru. În cazul în care medicamentul va rămâne apă este unit cu ulei de imersie, se va da o emulsie, care împiedică buna vizibilitate sub microscop.
vopsele
Vopsele utilizate pentru studii bacteriologice, fac parte din grupul de așa-numita anilină. Dar, din moment ce acestea sunt obținute nu numai de la anilină, ci și din cauza altor derivați de gudron de cărbune -. Benzen, toluen, etc, este mai corect să le numim vopsele pe bază de cărbune. aceste culori sunt împărțite în bază și acid. Termenii „acid“ și „de bază“ cerneală determină doar afinitatea unei anumite părți a celulei. Coloranți de bază pata miez bine și microbi. Acid microbi colorant pete slabe colorarea țesutului ele sunt colorate citoplasmă celulelor. Cele mai frecvent utilizate următoarele culori: albastru de metilen, tionina (vopsea albastră), fucsină de bază, eozină și safranina (cerneală roșie), bismarkbraun sau vezuvin (culoare maro), metilgryun (vopsea verde), metilviolet, violet de gențiană (vopsea mov). Dintre acestea, numai eozina - vopsea de acid. Este folosit pentru anumite scopuri speciale.
Toate aceste cerneluri sunt vândute sub formă de pulberi cristaline sau amorfe, și sunt deja pregătite soluții de coloranți.
Prepararea soluțiilor de colorant. Materia primă pentru vopsele care lucrează aproape toate sunt necesare soluții de alcool, care trebuie să fie păstrate în stoc și depozitate în flacoane cu dopuri saturate. soluțiile alcoolice saturate au fost preparate după cum urmează: 10 g de vopsea uscată se toarnă în sticlă capsulate, turnată în 100 ml de 96 ° alcool (rectificat) și se lasă să stea timp de câteva zile, agitând zilnic soluția. Din astfel de soluții saturate preparate pastvory alcool-apă potrivite pentru vopsirea microbilor. Cele mai utilizate frecvent următoarele soluții.
Carbolină magenta (magenta Tsilya)
10 ml dintr-o soluție saturată de fucsin alcoolică ml 5% acid carbolic 100
single magenta
10 ml de carbolice fucsin apă distilată 90 ml
Alkaline albastru de metilen, 30 ml de soluție alcoolică saturată albastru 100 ml apă distilată, soluție alcalină 1 ml de 1%
violet de gențiană carbolină 10 ml dintr-o soluție alcoolică gentsiaivioleta saturată 90 ml acid carbolic 5%
soluții gentsiaivioleta da precipitatele în vopsitorie. În schimb, puteți utiliza gentsiaivioleta soluții saturate de alcool sau kristalvioleta metilvioleta. soluții acide carbolice pot lua 1% în loc de 5%. Mai mult, pentru colorația Gram poate folosi 0,25% kristalvioleta metilvioleta apos sau fără carbolic acid. O soluție de lonjeroane și nu precipită.
Prin analogie cu albastrul soluției violet de gențiană este folosit în loc de bucăți de hârtie de filtru îmbibate în prealabil într-o soluție alcoolică și apoi se usucă vopseaua. În acest scop, foile de hârtie de filtru sunt scufundate timp de 1-2 minute în soluție de colorant 1-2% în 96 ° alcool, după care hârtia a fost uscată pe o frânghie sau sticlă întinse tije și se taie în bucăți de 2X4 cm. Aceste documente sunt stocate într-un borcane astupate pe termen nelimitat .
Metode de colorare simple microbi. In tehnica de laborator utilizate metode simple și complexe de microbi colorat. O metodă simplă de pictură numit pregătire de colorat de orice culoare. Astfel de metode includ fucsin colorare diluată alcalină sau albastru de metilen.
Colorarea magenta diluat. În frotiul diapozitiv pregătirea și fixarea acestuia flacăra arzătorului. Apoi, o formulare răcită timp de 1-2 minute turnat fucsin diluat. Vopseaua se clătește cu apă și formulare uscată.
Acoperirea de albastru de metilen alcalină (Loeffler). Pe un frotiu de diapozitive este pregătit și fixat-o pe foc. La frotiu răcit turnat albastru de metilen, timp de 2-3 minute. Vopseaua se clătește cu apă și formulare uscată. Când se colorează nucleu diferențiat și citoplasmă și, prin urmare, materialul patologic de colorare (puroi, exudat, și așa mai departe. D.) adecvată pentru a utiliza albastru de metilen.
metode sofisticate de microbi colorat. In metodele de microbi complexe de culoare de pe unul și același medicament afectează mai multe soluții coloranți. Metodele sofisticate sunt bazate pe structura fizico-chimice și afinitatea celulelor bacteriene la anumite vopsele microbiene. Aceste tehnici de colorare sunt importante în diferențierea microbilor. Pentru metode complexe includ colorația Gram, Ziehl - Nielsen, Neisseria, etc ...
Vopsirea microbi prin colorare Gram. Toți microbii în relația cu culoarea metodei Gram sunt împărțite în două grupe: a) bacterii Gram-pozitive sau grampolozhitelnye- b) Gram-negative sau Gram-negative.
Diverse legate de Gram coloratie depinde de diferențele de structură fizică și chimică a bacteriilor înseși. Pentru colorarea Gram metodă clasică necesită următoarele soluții:

1. violet de gențiană carbolină;
2. soluție Lugol (iod cristal 1 g iodură de potasiu 2 g și apă distilată 300 ml iodură de iod și potasiu au fost amestecate și dizolvate în 5 ml de apă, apoi se adaugă restul de apă);
3. alcool 96 °;
4. magenta diluat.

pictura tehnica Gram. Pe frotiul fix a pus hârtia de filtru, dimensiunea încă face frotiu. În această soluție violet hârtie gențiană a fost turnat pe I-2 minute. Fuzionată cerneala pe hârtie și, fără spălare cu apă de preparare, se toarnă 1- 2 minute soluție Lugol înainte ca înnegrire frotiu. Apoi, soluția Lugol a fost drenată și 1 / 3-1 minut turnat alcool 96 ° (medicamentul trebuie jiggle). Se spală cu apă și în continuare colorant magenta diluat (1-2 minute). vopsea condensată, se spală cu apă, se usucă și se mikroskopiruyut.
Metoda modificată a Gram (A. albăstreală). l.Ha frotiu fix benzi suprapuse de hârtie de filtru impregnat cu 1% kristalvioleta alcool soluție sau violet de gențiană.

1. Se aplică pe hârtie de 2-3 picături de apă și se lasă timp de 2 minute.
2. Hârtie îndepărtată cu forcepsul și turnat soluție Lugol timp de 1-2 minute.
3. Decolorată cu alcool (10-30 secunde).
4. În plus, fucsin colorate cu diluat (aproximativ 1-2 minute). _

Mecanismul de colorația Gram. REZUMAT Metoda Gram constă în faptul că vopseaua de metil gentsian- sau kristalviolet are capacitatea de a fi fixat ferm în celula bacteriană. În acest caz, nu se produce sub influența decolorarea alcoolului, microbul este colorat violet. Acest lucru înseamnă că este gram pozitiv. Dacă într-o celulă bacteriană vopsea nu va fi stabilită, apoi sub influența alcoolului microbi decolorat și percepe vopsea suplimentară - diluat magenta. Microbii sunt vopsite în roz, t. E. Ele sunt Gram-negative (Fig. 16 insert).
Colorarea microbilor rezistenți acide. Metode pentru vopsirea de acid bacterii pe baza capacității lor de a fi pictat mult coloranți soluție colorantă atunci când este încălzit. În acțiunea ulterioară a acizilor slabi, care nu sunt decolorate. Cu astfel de germeni tratate acide pot fi diferențiate de alte bacterii. Cele mai frecvente culoarea Ziehl - Neelsen.
tehnica de pictura. 1. La frotiul fix plasat o bucată de hârtie de filtru, pe care Guides magenta și preparare colorate cu încălzire la vapori de apariție triplă, după care vopseaua este lăsat pentru câteva minute și lăsat să se răcească preparare.

Fig. 16. colorația Gram aureus și Vibrio.

1. Fuzionată colorant și se spală cu apă de preparare. 3- decolorată cu acid sulfuric apos 5% (10-30 secunde).
2. Se spală cu apă.
3. Spălat cu alcool pur 10-15 secunde.

6. Alcoolul se spală cu apă.
7. albastru Dokrashivayut Leffler timp de 3-5 minute.

Decolorarea unui preparat poate produce, de asemenea, o soluție de acid clorhidric 3% alcool. Cu această metodă, pătează acidului Bacilii tuberculoși colorează roșu rubiniu culoare și alte bacterii acidorezistență - albastru (a se vedea Figura 88 în insert ..).
Acid- și rezistentă la alcool bacililor tuberculosi, deoarece acestea sunt compuse din acidul micotic, reacționează chimic cu fucsin fenolic. Acest compus surprinde vopseaua în celula microbiană, și, prin urmare, nu se decoloreze bastoane.
Colorarea disputa. Practica microbiologică folosind mai multe tehnici de colorare a sporilor (Fig. 17 insert).

1. Metoda Peshkova. La marginea diapozitiv face un frotiu subțire din culturi bacteriene, se usucă în aer și se înregistrează-alcool eter spirt- formol sau pas arzător flacără. O formulare fix este turnat Leffler arzător cu flacără albastră și se încălzește la fierbere timp de 15-20 de secunde. Se lasă să se răcească preparare, se spală cu apă și dokrashivayut 0,5% neytralrota apos 30-60 secunde. Vopseaua se spală și se usucă formulare. Sporii sunt colorate de culoare albastru sau albastru, forme vegetative - în roz.
2. Metoda lui Hansen. Medicamentul este fixat pe arzător de 5-7 ori cu un medicament fix plasat o bucată de hârtie de filtru, pe care Guides magenta, iar flacăra arzătorului este adusă la fierbere. Medicamentul este dat să se răcească ușor, acoperit fucsin fenolic și se fierbe din nou. Apoi, doliv Guides magenta, fiert pentru a treia oară. Prepararea a fost lăsat să se răcească, se spală cu apă, se decolorează cu soluție apoasă 5% de acid sulfuric timp de 20-30 de secunde și dokrashivayut albastru timp de 3-5 minute. Sporii ferm vopsea fucsin - roșu, o bacterie organism vegetativi decolora de la expunerea la acid sulfuric, colorate cu albastru de metilen la albastru (vezi Figura încorporabilă în 101 ..).

Fig. 18. Capsule din pneumococ.


Fig. 17. Litigii bacili.

Fig. 19. Capsulele de bacterii.

Acoperirea capsulelor. Acoperirea capsulelor folosind coloranți convenționali gestiona, metilen magenta albastru sau diluat, și cel mai bine în frotiuri de organe sau țesut fluid (fig. 18 insert). În aceste cazuri, corpul de microbi și de fond (celulele corpului) sunt colorate în albastru sau roșu, capsula este vizibil ca buză incolor care înconjoară microb.
Metoda fulii. La colorarea capsule în cultură pură de bacterii utilizate de Jin.
tehnica de pictura. 1. Într-o cerneală picaturii desen acoperit lamelă de sticlă și se diluează cu o cantitate egală de apă.

1. Scăderea rezultată este făcută cantitate mică de cultură agar sau bulion de bacterii și buclă mixtă.
2. Edge de slefuire îngrijorare de sticlă picături de cerneală și când cerneala se întinde pe marginea geamului, face un frotiu, frotiu de sânge.
3. Pătarea fix clorură mercurică într-o soluție concentrată de 1 minut sau flacără arzător.
4. Spălat cu apă (la fixarea sublimat coroziv).
5. fucsin fenolic pătată minute albastre sau 5-10.
6. Se spală cu apă, se usucă și se mikroskopiruyut.

Capsulele nu pătează, ci prin aplicarea rimelului reprezentat brusc definit, corpul bacterian pictat și se află în interiorul capsulei (fig. 19, insert).
Acoperirea boabe metacromă (volutin) de Neisseria. trebuie pregătite două culori: a) acetic Albastru Neisser, b) vopsea vezuvin sau bismarkbraun.
Xin Neisseria este format din două soluții:
soluţie A
Albastru de metil alcool etilic 0,1 g 2 ml de acid acetic glacial, 5 ml apă distilată 100 ml
soluția B
Kristalvioleta 1 g
alcool etilic (absolut) 10 ml Apă distilată 300 ml
Soluțiile A și B au fost amestecate imediat înainte de colorare de 2: 1.
Vopseaua vezuvin sau bismarkbraun, obținută prin dizolvarea a 1 g de pulbere în 300 ml apă fiartă distilată.
tehnica de pictura. O formulare fixă ​​este aplicată albăstrelii Neisseria 0,5-1 minute, se clătește cu apă și vopseaua este în continuare vopsită cu o soluție vezuvina 1-3 minute. După această preparare a fost spălată cu apă, se usucă și se mikroskopiruyut. In acest proces, bacteriile sunt colorate într-o culoare maro deschis, și cereale metacromă - albastru (Figura 83 în insert.).
In unele laboratoare, având în vedere metoda clasica de Neisseria modificate oarecum. albastru Acetic este aplicat timp de 4-5 minute, se spală cu apă. Apoi medicamentul este turnat în soluție V2-1 minute Lugol, este turnat și vezuvinom dokrashivayut timp de 1-V2 minute.
Pictura pe Romanovsky-Giemsa. Paint Giemsa - amestec Azure (colorant organic obținut din albastru de metilen) și eozină albastru de metilen. Ca și în soluția albastră, care colorează citoplasmă celulei de culoare albastră și nucleele celulelor, granulozitate, mucus, capsule bacterii - de culoare roșie-violet.
Acoperirea Romanowsky-Giemsa este una din tehnicile de bază în studiul morfologiei protozoare, spirochete și în investigarea celulelor sanguine.
Metoda de aplicare. La 10 ml de apă distilată a fost reacție neutră sau ușor alcalină imediat înainte de colorare a medicamentului a fost adăugat 10 picături de vopsea și turnat imediat pe un medicament fix (sau de droguri a fost scufundat într-un pahar de laborator cu vopsea). După 1 oră vopseaua este turnat, medicamentul a fost spălat cu apă, se usucă în aer și testate. Atunci când sunt plasate cu formularea de vopsea într-un incubator la 37 °, colorația are loc mai rapid (30-40 minute). Rezultatele colorării depind de proprietățile de apă, astfel încât ar trebui să verificați reacția ei.
De colorat pentru rickettsii Zdrodovsky. Fix frotiu subțire al flăcării arzătorului. Colorarea produc fucsin diluat carbol (10-15 picaturi magenta per 10 ml apă redistilată) timp de 5 minute. preparare pictat a fost spălat cu apă și apoi decolorată într-o soluție a unui acid organic sau mineral (acid citric 0,5%, 0,01% acid clorhidric), timp de 2-3 secunde. Preparatul a fost apoi spălată cu apă și dokrashivayut soluție 0,5% de albastru de metilen timp de 1,3 minute. În pregătirea pe un fond albastru va fi Rickettsia înroșită vizibil (Fig. 116 insert).

Studiul microorganismelor într-o stare de viață

Deoarece metodele de detecție sunt flageli dificile, iar determinarea mobilității bacteriilor servește pentru determinarea speciei lor, în practica de zi cu zi de laborator pentru a determina mobilitatea observării utilizării bacteriilor în stare vie - în picătură zdrobit sau agățat.
paie zdrobit. In mijlocul buclei sau picătură pipetă materialul de testare acoperit diapozitiv. Această scădere este acoperit cu un capac de sticlă, acoperit ușor cu ajutorul unei pensete, astfel încât lichidul să nu se formează bule de aer. a făcut în mod corespunzător o picătură umple spațiul dintre capacul și diapozitivul, dar lichidul nu iese dincolo de marginea geamului de acoperire. În cazul în care este necesar ca medicamentul să fie luate în considerare pentru o lungă perioadă de timp, marginile lamelei prelubrifiate cu vaselina.
Agățat picătură. O picătură din materialul testat este aplicat pe mijlocul acoperite cu sticlă. Apoi, geamul capacul este rotit rapid verticală și a pus pe o lamelă de sticlă cu o degajare ( „gaura“), în mijloc. Picătură ar trebui să atârne liber în locașul fără să atingă fundul și marginile acesteia (Fig. 20). Marginile locașurilor de pe diapozitiv pentru a fi pre-lubrifiate cu vaselina. Astfel, scăderea este închisă ermetic într-o cameră umedă și protejat de uscare.
Definirea mobilității în microbi utilizate în diagnosticul de laborator al dizenterie, holeră, febră tifoidă și alte boli.
In studiul de microbi vii pentru a fi distins bacterii activ motile, indicând prezența flagelilor lor invizibil, de la (browniene) mișcări pasive moleculare comune tuturor suspendate în particulele fine de lichid (corpusculii, granule, particule de praf, microbi ca lipsite de flageli și uciși) .

Fig. 20. agățat picătură.

Cercetarea în domeniul întunecat de vedere. Mișcarea bacteriilor și spirochete pot fi observate la microscop, care este diferit de aplicarea normală a iluminatului lateral luminos, în care imaginea grafică a obiectului luminos pe un fundal întunecat. Principiul câmpului întunecat se bazează pe faptul că razele de lumină sunt deviate particulele dense care se încadrează într-o parte (cum ar fi bacteriile) și ultimul prin ochiul observatorului sunt reprezentate de luminoase. iluminat lateral la microscop poate fi obținut prin înlocuirea convențională iluminator condensatorului special cu umbrire în centru. Un astfel de condensator deține toate razele de lumină centrale și transmite doar periferic. Abordarea noastră este după cum urmează. Aplicată pe o lamelă de sticlă și o picătură din materialul testat este acoperit cu o lamelă ușor pentru a evita bulele de aer. Apoi, condensatorul de suprafață a fost plasată o picătură de ulei de apă sau de pin, iar glisiera cu preparatul este introdus pe picătură.

agenți coloranți: Video: citologie-2