Completează testul de fixare - microbiologie cu tehnica testelor microbiologice

fixare a complementului (RSK)
Compusul anticorp la un antigen și complement nu sunt însoțite neapărat de distrugerea antigenului. Acest lucru. în principal, se referă la microbi, care sunt rezistente la acțiunea litică a complementului. Ceea ce se întâmplă în aceste cazuri, legarea complementului poate fi detectată în mod indirect prin utilizarea unei metode de deschis și S. J. Bordet Gengou. Esența metodei este următoarea. În reacția serului imun cu un antigen specific se produce antigen compus cu un anticorp complexat cu anticorp-antigen, care se leagă de complement. În cazul antigenului inconsistențe și legarea anticorpului nu se produce complement, adică. E. Complementul rămâne liber. Legarea complementului la o reacție de anticorpi pozitiv cu antigenul rămâne invizibil. Prin urmare, pentru a determina dacă complementul contactat sau lăsat liber, ca indicator în reacție este introdus sistemul hemolitic (ser hemolitic - hemolizină și celule roșii de oaie din sânge). Testul de fixare a complementului este plasat în două faze: în prima fază a serului investigat (anticorp) este adăugat la antigen, și să completeze, al doilea - se adaugă hemolitic sistem.
În cazul în care prima fază cuprinde reacția anticorpilor serici specifici pentru antigenul respectiv, complementul este asociat cu antigenul + anticorp, adăugând hemolitice hemoliza nu are loc, iar sistemul de reacție va fi considerat pozitiv.
Dacă serul de testat nu conține anticorpi specifici, adică. E. Un antigen și un anticorp care nu se potrivesc reciproc, apoi se completează în prima fază de reacție rămâne liber și adăugarea sistemului hemolitic va hemoliza (dizolvare) a eritrocitelor, t. E. Reacția este negativă (vezi . Fig. 57).
Reacție Bordet-Gengou (fixare a complementului) cu sensibilitate ridicată, a câștigat o valoare mare de diagnostic. Această valoare este mărită și mai mult atunci când Gengou a arătat că reacția poate avea loc nu numai cu organismele bacteriene, dar, de asemenea, cu extracte lor. Reacția Bordet-Zhang utilizate în diagnosticul răpciugă, gonoree și alte boli. A. Wasserman, bazat pe ideile lui J. Bordet, aplicat reacția de fixare a complementului pentru serodiagnosis de sifilis. Această reacție a primit aplicarea practică în detectarea sifilis.
Testul de fixare a complementului este utilizat cu un dublu scop:

1. Pentru detectarea anticorpilor specifici în ser prin antigen cunoscut. De exemplu, cu un antigen preparat dintr-o cultură a gonoreei, gonococica poate detecta anticorpi în serul pacientului. În acest caz, este necesar să se utilizeze o doză de antigen care leagă de complement, pre vytitrovana un număr considerabil de pacienți seruri.
2. Pentru a determina forma antigenului folosind un ser conținând anticorpi la un antigen specific. De exemplu, folosind serul imun corespunzător poate fi identificat bagheta pertussis. În aceste cazuri, este necesar de a avea un ser imun puternic, din care titrul este cunoscut.

Ingrediente (părți) de reacție. Pentru reacția de cuplare, complementară coagulant următoarele ingrediente sunt necesare: 1) eritrocite de oaie, 2) hemolitică ser, 3) Complement, 4) antigen și 5) ale serului de test.
1. Hematiile sunt obținute din defibrin de sange-lea e oaie. În acest scop, sânge de oaie a fost luat din vena jugulară direct în borcan cu mărgele de sticlă. Agitat timp de 10 minute. Prin tifon steril Filtrată, centrifugat și serul a fost aspirat. Eritrocitele au fost spălate de trei ori cu soluție salină ser reziduu de centrifugare clorură de sodiu timp de 10-15 minute. După a treia centrifugare a sediment prepara o suspensie de 3% din celulele roșii din sânge pentru experiment. Când sunt depozitate în sânge ghețar defibrinat poate fi folosit timp de 6-8 zile.

Schema preparare diluții ale serului primar diluția hemolitica 1: 100

1. ser hemolitic este de obicei obținut de la iepuri imunizați cu celule roșii din sânge de oaie. ser hemolitic produse în instituții formă uscată preparate bacteriene. Amplasat pe eticheta titrul de ser fiolă și data de expirare.

TABELUL 4
titrarea Schema hemolitice serice

Titrul hemolitic Ser numit diluție limită al acestuia capabil într-un volum de 0,5 ml dintr-o soluție de 0,5 ml dintr-o suspensie de 3% de eritrocite în prezența a 0,5 ml de complement timp de o oră la 37 °.
Titrul hemolitica seric se determină după cum urmează: se prepară diluții vyvorotki de bază 1: 100 (0,1 ml ser + 0,9 ml soluție salină), din care sunt preparate diluții suplimentare (Tabelul 3).
Numărul de tuburi dozează secvențial în 0,5 ml de diluții de ser hemolitic obținute variind de la 1: 1000, a fost adăugat la fiecare tub de 0,5 ml complement diluat 1: 10 și 0,5 ml de suspensie 3% eritrocit. Titrarea schemei ser efectuat hemolitice (tab. 4).
văzut din diagrama că zer are o diluție de 1: 1500 dă hemoliza completă (adică titru seric de 1: .. 1500). luate ulterior de 3 ori pentru experimentul de diluare minimă (triplu titru). De exemplu, dacă hemolitică titrul seric de diluție 1: 1500 este folosit 1: 500 (.. Ie 0,1 ml de ser de 49,9 ml de soluție salină).

1. Complement. Ca o completare a reacției servește ca ser de cobai (complementa le are cea mai mare activitate) sau complement uscat, disponibil de la instituțiile preparatelor bacteriene.

Având în vedere că gradul de activitate al complementului, nu toți porcii de guinea este același, trebuie să luați sângele mai multor animale și se amestecă ser derivate.
Titrul de complement indicată de prima doză minimă de a completa dizolvare eritrocite. Dacă, de exemplu, în titrare diagrama hemoliza completă a avut loc într-un tub conținând 0,3 ml de complement și hemoliză incompletă a fost în eprubetă conținând 0,25 ml de complement, titrul complement trebuie luate în considerare în 0,3 ml diluție 1: 10. doza de lucru este luată de obicei titrului său complement, a crescut cu 20-25%, m. e., aceasta corespunde aproximativ cantității de complement, care este conținută în tub penultima cu hemoliză.
Deoarece doi de control (vezi. Tabelul 5.) Sunt plasate în titrarea serului hemolitic și în titrare complementului.

Schema de titrare Complement fără antigen

TABELUL 6
Schema de titrare a complementului în prezența antigenului

În plus, este recomandabil să se titra complementului în prezența antigenului.
Titrarea complementului în prezența antigenului necesar, în acele cazuri în care antigenul inhibă titrului complement (proprietate antigen anticomplementară). Această proprietate poate depinde atât de natura antigenului și metoda de preparare a acestuia.

1. Antigen. Fixarea complementului folosind diferite antigene. Antigeni sunt culturi microbiene diverse sau extracte de țesuturi anormale sau normale. Ca antigen bacterian poate fi utilizat ca suspensia microbiană în soluție salină, și extractele microbiene preparate în diverse moduri (de exemplu, antiforminovy ​​antigen gonococici alcool tuberculoasă și t. P.). Bune proprietăți antigenice suspensie microbiană are anterior perechi formol ucise sau tratate cu alcool. Pentru reacția suspensiei de pornire este de antigen diluat pe standardul optic cuprinzând. 1 mld. Organismele microbieni în 1 ml și luate într-un volum de 0,5 ml.

Așa cum se utilizează, de asemenea, lizat antigen microbian în apă sau soluție salină distilată obținută în aparat shyuttel (agitator) sau prin antiforminom tratament.
Pentru reacția trebuie utilizată o astfel de doză de antigen care provoacă o hemoliză totală întârziere cu seruri conținând hemolizinei corespunzătoare, dar care în sine nu întârzie hemoliză. În virtutea faptului că toate antigenele microbiene sunt adsorbiți o anumită cantitate de complement, inainte de titrare lor testate pentru proprietățile anticomplementare, determinând dizolvarea a complementului de dozare, adică. E. Cea mai mare cantitate de antigen care nu provoacă întârzierea hemolizei. Determinarea unor astfel de doze de antigen solvent produs prin schema (Tabel. 7).
Din tabel se poate observa că în acest exemplu doza de antigen de solvent este de 0,4 ml. Pentru experiment, ia o jumătate de doză, t. E. Este doza aproximativă este de 0,2 ml.

1. Serul de test. seruri pacient au fost separate de cheag de 3-48 ore după de sânge și inactivat într-o baie de apă la 56 ° timp de 30 minute.

Tabelul 7 Determinarea dozei de antigen circuit de dizolvare

ser inactivată pot fi depozitate în frigider timp de 5-6 zile. Pentru reacția serului pacientului este utilizat la o diluție de 1: 5 (0,1 ml ser + 0,4 ml soluție salină).
Formularea de fixare a complementului experiență (tabelul. 8).
Pentru a pune o fixare a complementului sunt necesare următoarele ingrediente:

1. ser fiziologic (0,85%);
2. ser să fie examinat, inactivat la 56 ° timp de 30 minute într-o baie de apă;
3. antigen (suspensie de bacterii sau un extract din acestea), fără a provoca hemoliză, nici independent, nici întârzia în titrare a dozei instalate;
4. completează în ajustarea dozelor de lucru instalate;
5. ser hemolitic într-o doză de trei ori titru acesteia;
6. suspensie 3% de eritrocite de oaie.

Fiecare dintre ingrediente, care este utilizat pentru reacția este luată într-o cantitate de 0,5 ml. Dacă doza de componente individuale este mai mică decât această sumă, apoi soluție salină sau complement la 0,5 ml.
Principala experiență Fixarea complementului este de dorit să se pună doar două - trei antigene preparate în diferite moduri (A1, A2, A3 în tabelul 8.).

Experienta de conducere primara

Pentru a controla reacția în același timp, este necesar să se pună în exact aceleași condiții cu ser normal și ser care produce în mod deliberat un rezultat pozitiv. Atunci când reacția este primă formulare amestecată a serului, antigenul și complement. Amestecul a fost incubat la 37 ° C timp de o oră. După acest timp amestecul a fost adăugat la un tub de testare și hemolitic eritrocitele ser - sistem hemolitică. Sistemul hemolitică este adăugat în mod direct sau după amestecarea de volume egale de eritrocite hemolitice serice și, după o jumătate de oră sau menținerea amestecului într-un termostat. Amestecul tuturor ingredientelor, după o agitare puternică a fost plasat într-un termostat la 37 ° timp de 1 oră, și apoi transferat timp de 12 ore la frigider sau lăsat la temperatura camerei.
Tuburile în care a avut loc hemoliza, lichidul devine transparent, dar colorată (vezi. Fig. 58).

Fig. 58. Circuitul de fixare a complementului.
și - polozhitelnaya- reacție b - reacție negativă.