Bacteriofag - microbiologie cu tehnica testelor microbiologice

Bacteriofagi sunt virusuri, bacterii, care trec prin filtrele și melkopornstye proliferează în detrimentul bacteriilor vii tinere. Bakteriofagiya- este procesul de interacțiune a bacteriofag sau bacterii în traducere exactă înseamnă „bacteria devoratoare.“ bacteriofagilor izolate recent si ciupercile radiante - actinomicete. Bacteriofagi sunt larg răspândite în natură. Acestea se găsesc oriunde este potrivit pentru microbi lor existență: apă, sol, lapte, pe fructe si legume, la oameni și la animale sănătoase, etc sunt ele alocate din defecating în dizenteria, febra tifoidă, holera, de puroi si mucus .. în alte infecții.
Primele observații ale fenomenului bacteriofagului aparțin celei mai mari microbiolog sovietic NF Gamal, care în 1898 a arătat că o suspensie groasă de bețișoare de antrax în apă distilată poate fi antireflex și de a dobândi capacitatea de a dizolva bacteriile.
D&rsquo-Erell (1917) a fost mai întâi supusă unui studiu sistematic al fenomenului de bacteriofagi. Pentru prima dată Dr.&rsquo-Erellem fagi a fost găsit în materiile fecale ale persoanelor în convalescență după dizenterie. O picătură din filtrat din fecalele persoanei bolnave incluse în tijele dizenterie tub de cultură determină dizolvarea treptată a bacteriilor. În acest caz, d&rsquo-Erell stabilit următorul fapt de bază: capacitatea de a provoca culturi de iluminare dizenterie asociate cu dizolvarea bacteriilor existente în aceasta, nu este epuizat numai în timp de dizolvare, și invers, crește. Picătură de lichid luminat transferat într-o suspensie proaspătă de bastoane dizenterie, lizate, din nou. Pentru a ataca fenomenul etc.&sunt necesare rsquo-Erellya două condiții: principiul activ - bacteriofagul și bacterii vii de reproducere.
Fiecare tip este caracterizat printr-o anumită dimensiune a particulei de fag. Dimensiunea fagii variază între de 20 până la 200 nm, m. e. egal cu dimensiunea virusurilor. Sub un microscop electronic, fagul apare sub formă ovală, cu apendice, asemănătoare cu forma spermatozoizilor (Fig. 44). cap fagic constă dintr-un înveliș proteic și umplut cu un conținut granular (acid dezoksiribonuklennovaya). Porțiunea coadă este o teacă cilindrică și un miez, care seamănă cu un ac de seringă. Scion fagi 1,5 ori mai mare decât capul și de 4 ori mai subțire (fig. 45). Există fagi rotunde și tijă. Compoziția bacetriofagilor includ: proteine, ADN sau ARN, carbohidrați și lipide.

Fig. 44. Morfologia bacteriofag.

Video: bacteriofagi și terapia de fagi

Fig. Structura circuitului 45. unui bacteriofag.
Lovirea o celulă microbiană, fagul se atașează la suprafața flagella, situată na sfârșitul procesului. Apoi, bacteriile izolate fagi situs de atașare, se formează o deschidere prin care pătrunde în acidul deoxiribonucleic celular (ADN) fagului. ruperea membranelor bacteriene datorită prezenței în enzima fagului litic, situată în partea din spate a plicului fagului. Celula bacteriană sub influența fagului înrădăcinat suferă modificări structurale și biochimice. În acest caz, se întâmplă multiplicarea și acumularea de noi particule de fag. Celulele microbiana se umfla, cresc în dimensiune, apoi se rupe coajă și fagii sunt eliberate. Particulele de fagi eliberate a lovit din nou celulele bacteriene. Numărul de fagi în aceeași celulă poate ajunge la 200-1000.
Prin natura interacțiunii cu celula bacteriană distinge între fagii virulente și temperate. fagii virulenți a lovit-l sensibil la microbi se multiplica în ele și să stea miercuri, în timpul liza celulară. Fagii temperata infectează celulele sensibile, dar cauzează liza doar o singură parte, pentru a forma un fag bacterian vegetativ, majoritatea celulelor devin imune (imunitate) la infecția ulterioară cu această fagul. În astfel de celule, fagii nu reproduc, rămân într-o stare de simbioza și nu provoacă liza bacteriilor care sunt numite prophage. Bacteriile care transportă astfel de prophages numit simbioză lysogenic și celule cu prophage - lysogeny. bacterii lysogenic sunt frecvent întâlnite în natură. Eliberarea culturilor lysogenic bacteriofagi pot fi cauzate de radiații ionizante, peroxid de hidrogen și de alți factori de mediu. Apoi, cultura lysogenic devine nelizogennoy și este capabil de a produce bacteriofagilor virulente.
Fagii au o specificitate pronunțată, t. E., acestea sunt dizolvate sau anumite tipuri de bacterii. Distinge monophages liză microbiană o polyphages specie - activi împotriva unui număr de specii înrudite și tipuri și fagi capabile să lizeze numai anumite tulpini ale aceleiași specii bacteriene. În același timp, fagi au capacitatea de a se adapta la alte tipuri de bacterii.
În comparație cu majoritatea fagului unicelulară organisme este rezistent la influențe externe. Lumina solară directă și lumină ambientală distruge activitatea în 2-3 zi- când sunt expuse la raze ultraviolete fagi moare după 10 minute. Cele mai multe fagi poate rezista la căldură până la 70 °. Dezinfectanții chimici și bacteriofagul mai rezistente decât bacteriile. De exemplu, eter, cloroform, alcool, toluen, timol, cresol, acetonă, 0,5% soluție de clorură mercurică, soluție de fenol 1% a fost aproape nici un efect asupra fagului. Bacteriofag are o sensibilitate ridicată la acid și înainte este necesar să se bea ingerarea soluție de sodă slabă pentru a neutraliza conținutul de acid al stomacului.
Activitatea fagi împotriva microbilor pot varia în mod corespunzător.
Fagii au fost indicate mai sus, sunt virusuri, paraziți, bacterii și actinomicete. La animale sălbatice fagi arată structura sa, mecanismul de acțiune privind multiplicarea bacteriilor, capacitatea de a se adapta și variații ereditare.
Pentru detectarea fagului analizat materialul lichid (apă, lapte) a fost centrifugat. Scaune și alte materiale și consistență semisolidă înainte de centrifugare a fost diluată cu ser fiziologic. Supernatantul obținut într-o cantitate de 1 ml a fost transferat într-un flacon cu 30 ml bulion de carne-peptonă, pre-însămânțate cu 1 ml de tineri (6-18 ore) cultura unui microorganism potrivit fagului dorit. Însămânțării pus într-un termostat la 37 ° C timp de 24 ore. Apoi cultură a fost filtrată prin filtru Seitz, iar filtratul este diluat cu soluție salină sterilă de 1: 10, 1: 100 și 1: 1000. De la fiecare diluție de 1 ml se transferă într-o eprubetă și se adaugă 0,05 ml din cultura de bacterii adecvate. Controlul servește flacon cu 1 ml de bulion conținând bulion de cultură de microorganisme fără filtrat. Toate tuburile au fost plasate într-un termostat. 18-20 de ore reprezintă rezultatul. mediu de cultură iluministă indică prezența fagului test in vitro au indicat creșterea normală a culturii.
Detectarea fagi pe mediu solid. plăci Geidenreich Petri au fost turnate 1,5% carne-peptonă agar agar se răcește, apoi suprafața este inoculată uniform posibil 16-18 oră bulion de cultură de bacterii din fagul omolog dorit. Însămânțarea trebuie să fie continuu pe întreaga suprafață a agarului. După 5-10 minute, la suprafața testului de agar nutritiv uscat filtratelor picături aplicate în diferite sectoare ale cupei. După ce lichidul absorbit în cupa medie întoarsă cu susul în jos și plasate într-un termostat la 37 ° C timp de 24 ore. În prezența bacteriofagului la locul Picăturile de aplicare poate fi o creștere absentă de bacterii, sau colonii care apar fără sâmburi, muchii sau centru, sau o multitudine de secțiuni complet delimitate steril - spoturi sterile (Fig 46.).

Fig. 46. ​​Fenomenul de bacteriofagi.
Conținutul cantitativ al fagilor detectate prin titrare.
Titrarea bacteriofagului într-un mediu nutritiv lichid și metoda Appelman. La titrare în 10 tuburi cu un diametru egal se toarnă cu 4,5 ml bulion. Primul tub este format din 0,5 ml fagul de test. Apoi, fac diluții seriale prin transferarea pipete separate într-un tub de testare dintr-un tub de testare, 0,5 ml fagul diluat. Din ultimele 0,5 ml și amestecul a fost turnat în fiecare tub s-a adăugat o picătură de 18 chasovop bulion de cultură 11-i și 12-i sunt flacoane de control. Prima dintre ele este bulion și cultură (fără fagului), în bulion de carne peptonpy a doua (controlul sterilității). Toate tuburile au fost plasate într-un incubator la 37 ° C timp de 18 ore. Ultimul flacon care conține un mediu transparent, determină titrul fagului. Titrul de fagi - cea mai mare diluție în care există liza completă și în mod condiționat desemnate ca o diluție negativă. Dacă ultimul tub, în ​​care bulionul rămâne limpede, 8, titrul acestei fagi este 10-8.
Titrarea bacteriofag și un mediu nutritiv solid pe straturile de agar metoda Graz și. Această metodă este după cum urmează. plăci Geidenreich Petri au fost turnate 1,5% agar simplu într-o cantitate de 25-30 ml. Pentru a suprima microflorei aer agar creștere s-a adăugat la soluție alcoolică 0,004% din violet de gențiană (0,1 ml vopsea per 100 ml de agar). Agar sigilate cu hârtie de filtru steril și a fost uscat bine sub o lampă germicid pentru câteva ore sau într-un cuptor timp de 30 minute. Cupa acoperit cu un capac și lăsat până a doua zi la temperatura camerei. Apoi, diluții diferite de fagi a fost preparat ca în metoda de titrare a Appelman. Tuburile care conțin 2,5 ml topită și ostuzhennoy la 44-46 ° 0,7% agar, face diluție 1 ml fag titrat și 0,1 ml cunoscute a fi sensibile la acest fagului, cultura de bacterii. Tuburile sunt agitate prin rotirea lor între mâinile sale, iar al doilea strat este turnat în paharul cu 1,5% agar. După distribuirea uniformă a amestecului în pahar se lasă timp de 30 minute la temperatura camerei, iar apoi acestea sunt plasate într-un termostat la 37 ° C. După 18 ore într-un termostat contoriza numărul de colonii negative (de pete sterile) pe 2-3 plăci cu cea mai mare diluție a fagului. Din aceste date aritmetică înseamnă numărul scoase colonii și valoarea rezultată este înmulțită cu gradul maxim de diluție. De exemplu:
Coloniile de reproducție de fagi 10-6 82,
»» 10-7 51 colonie
»» 10 26 august ~ colonii.
Numărul mediu de colonii de fagi 53 (159: 3). Titrul bacteriofagului test este: 53H10-8.
Semnificația practică a fagului variat. Este folosit ca un efect terapeutic și profilactic (dizenteria, holera etc.). In practica chirurgicale utilizate stafilococică,, Proteaceae și Pseudomonas bacteriofagi streptococice și bacteriofag împotriva agenților patogeni anaerobi de infecție, care este folosit topic pentru irigarea rănilor pansamente umede tamponada.
operează în mod activ Preparatele polivalenți care constau dintr-o multitudine de tipuri diferite de fagi împotriva o specie de bacterii, și smesp din diferite bacteriofagilor.
Fage ca un drog, este o cultură bacteriană bulion de filtrat fagului supus liză. Este foarte clar, liber de bacterii vii de culoare galben-pai lichid. fagic uscat prepararea tabletelor cu amidon sau zahăr. fagi lichid într-un loc răcoros și uscat, își păstrează activitatea sa de 0,5-2 ani, și uscat, după 4-6 luni de depozitare își pierde în mod semnificativ puterea.
În microbiologice fagii laboratoarelor utilizate în scopuri de diagnostic, fenomenul de liză poate fi utilizat în două moduri:
a) pentru determinarea culturii selectate folosind fagi accesoriu tipic care izvestna-
b) pentru a determina tipul detectată folosind sensibilitatea bacteriofag la bacterii cultura.
culturi bacteriene Phage dactilografiere (febra tifoidă, dizenteria) are o importanță epidemiologică, permițând stabilirea sursei și calea de infectare.
Pentru diagnosticarea rapidă a mai multor boli infecțioase (febră tifoidă, dizenterie, ciuma, etc.) În practică microbiologică VD Timakov și D. M. Goldfarb a introdus reacția creștere a fagului titru (RNF). Esența acestei reacții constă în faptul că materialul testat a fost adăugat la o anumită cantitate de trasor (specific) fagilor și pus într-un termostat. Dacă materialul de testat sunt bacteriile depuse fagului corespunzătoare, fagul va crește numărul de corpusculi, altfel titrului bacteriofag va fi egal cu original (tehnica setarea RNF descrisă în secțiunea „diagnosticul microbian dizenterie“ p. 261).
Detectarea fagi în apă poate fi un indiciu al contaminării din urmă microflorei corespunzătoare.
În ultimii ani, fagul este utilizat pe scară largă ca un model genetic pentru studiul multor probleme biologice ale geneticii moderne.