Ergot paspalovaya - ciuperci microscopice toksinobrazuyuschie

Claviceps paspali Stev. paspalovaya et Hall.-ergot
Klavitsepspaspalitoksikoz (Clavicepspaspalitoxicosis)
Distribuit în specii Paspalum în țările tropicale și subtropicale. Otrăviri apar ambele animale pe pășune, și în timpul locuințelor când hrănite cu scleroți fân de fungi. O astfel de otrăvire a avut loc, de exemplu, în Australia, Noua Zeelandă, Africa, America de Sud, SUA, Turcia și alții. În URSS, primul raportat în 1942 de pe coasta Mării Negre din vestul Georgiei privind digiiaria Paspalum și P. dilatatum.
La bovine, cai și măgari au fost observate boală cunoscută sub numele de „Bandana“ (Magradze, 1948).
Potrivit Salikova (1944), la cai se produce intoxicații mai severe decât la bovine și porcine. În forma sa cea mai severă apare la animale subnutriti și viței. animalele bolnave susceptibile de a re-infectie. Boala se dezvolta in 2-6 zile de la începerea hrănirii furajului contaminat (iarba).
Toxic acționează substanțe ciupercii asupra sistemului nervos central al animalelor. Primul semn al bolii - necoordonare. Apoi, caii apar tremor muscular, depresie, și limitarea mișcării, corpul balansoar înainte și înapoi, în lateral. Vacile sunt marcate salivație temporare, nestabilitatea mers, timiditate, unele - dilatate elevi, iritabilitate. Temperatura corpului rămâne normală sau scade sub normal. mucoasa hyperemic a gurii. Pulsul de umplere slab. Peristaltismul întărit oarecum. În funcție de durata bolii (de la 2-3 zile la 1-2 luni sau mai mult) animalele belșugul redusă pentru a finaliza epuizare. Redus producția de lapte. Dar carnea și laptele animalelor infectate la om sunt inofensive.
La autopsie se găsesc, de obicei, leziuni focale locale ale mucoasei gastrice, modificări degenerative ale mușchiului inimii și a hiperplazia limfatic, în special mezenterici, zhelez- pe mucoasa inflamate de stomac, există zone eritematoase și în cantități mici, hemoragiile petesiale. Mai pronunțat hiperemia focal și hemoragiile focale în mucoasa intestinului subțire. Membrana mucoasa a colonului și intestinului orb hiperemia focala si uneori hemoragica inflamate. Există injecție vasculară spinale și cerebrale și degenerare parenchimatoase hepatice.
După două sau trei zile după schimbarea animalelor pentru hrana animalelor recupera.

Fig. 13. Structura anumitor alcaloizi de C /, purpurea:
și - tetraciclice nucleu alcaloizi din ergot, 6 - derivați ai acidului lisergic, a - derivați ai alcaloizilor clavine.
măsuri preventive împotriva bolii sunt în fân secerișului devreme pentru a forma stadiul conidii (sfatselii) și scleroți, împiedicând hrănirea plantelor infectate, paspaluma distrugere (Paspalum) în tufișuri și m. P.
În cazul în care otrăvire CL paspali bovine, cabaline și ovine remarcat faptul că scleroți mature sunt mai puțin toxice.
decât mai tânăr, dar este mai toxic decât ciuperca în etapa sfatselii (Pido Plichko, 1953).
Multe lucrari dedicate studiului diferitelor aspecte ale biologiei ergot și ergotismul, ecologia fungice, sensibilitatea diferitelor soiuri de secară la infecție, condițiile de infecție artificială, efectul diferitelor condiții privind toxicitatea scleroți, natura chimică ergotoxine et al. Au fost înregistrate progrese semnificative în studiul chimiei si ergotoxine farmacologie In ultimii ani, precum și metoda culturii ciupercilor saprofite.
In prezent, un număr mare de toxine descrise alcaloizi din ergot și derivați ai acestora care posedă o activitate biologică ridicată și este utilizat pe scară largă în medicină. alcaloizi de ergot reprezentat de două tipuri majore: klavinalkaloidami, derivații lor și alcaloizi peptidici, derivați ai acidului lisergic. Structura acestor tipuri includ o serie de structuri și proprietăți ale toxinei (Fig. 13), similar, dar diferit.
Alcaloizii tip Clavinova, avand la baza ergoline (argoklavin, elimoklavin și colab.), O structură destul de simplu, cu o greutate moleculară de aproximativ 250. In cultura saprofite ele sunt relativ simple. Mai complicat toksinogenez polipeptidic tip alcaloizii având o compoziție de lisergic și acid isolysergic. Greutatea moleculară a acestor alcaloizilor este de aproximativ 600 de acestea sunt marcate predominant în miceliu C /, purpurea. Toksinogenez formare și alcaloizi din ergot la cultura saprofite la metodele de suprafață și de cultură profundă au fost studiate de mulți autori (Abe și colab., 1953, 1955, 1961, Taber 1966, Taylor și colab 1957., 1960, și colab.).
Alcaloizi Neklavinovye reprezentat perechi epimerice - derivați amidici ai acidului lisergic și isolysergic. Posedă activitatea biologică a derivaților acidului lisergic.
Acid lisergic conține chinolină și indol prezență struktury- ultimă caracteristică face soluții de colorare sinefioletovoe cu glioxalic și acid sulfuric concentrat, care este utilizat în determinarea cantitativă și calitativă ergotal oidov cal.
derivați amidici ai acidului lisergic simple (ergometrine și ergometrinin) formează o serie de compuși derivați din lanț peptidic policiclic (ergotamină și ergotaminin) - alte serii (Tabelul 1.).
In prezent, un număr mare de derivați ai descris alcaloizilor clavine lisergic și izolată din scleroți culturii saprofite sau C /, paspali și C /, purpurea, farmacologica diferite, toxice și alte proprietăți. Astfel, ergotoxine, ergotamină, ergozin acționează asupra musculaturii netede, constricția pupilei, vasele de sânge, determinând țesuturile malnutritia (cianoza și cangrenă), motorii paralizează nervilor simpatici. Ergometrină într-o mare măsură, reduce muschii uterului, dar mai puțin toxice (nu produce cangrenă).
Determinarea toxinelor produse prin diferite metode: reacții farmacologice, chimice și colorate prin intensitatea fluorescenței, UV-spectrometrie și cromatografia (Vining, Taber, 1963).
Tabelul 1
Scurtă descriere a unor alcaloizi de Cl. purpurea

tulpinile obținute CZ |. purpurea, formând culturi parazite și saprofite predominant alcaloizii clavine sau alcaloizii de acid lisergic.
Vining și Taber (Taber, Vining, 1960) a fost studiată în cultura ergotalkaloidobrazuyuschie proprietăți de deformare saprofite la 41 C /. purpurea, extrase din diferite plante, Aspergillus Flavus, Conyothyrium fuckelii, Ustilago Bulata, U. trebouxii, U. maydis, Penicillium roqueforti.
Este de notat detectabili tulpinile cantitate ergotoxine la 18 C /. purpurea și formarea în P. roqueforti substanțe similare în valoare Rf pentru elimoklavinom și penniklavinom argoklavinom. Din sursa de carbon studiat cele mai potrivite pentru formarea de alcaloizi dovedit amestec galactoză, cu o creștere glyukozy- nu se observă în mediul cu gluconat și dulcitol. Ca surse de azot, amoniu sa dovedit mai mult acid adecvat chihlimbar, făină de soia, uree, extract de drojdie. Pe mediu cu azotat de potasiu, uree și / -triptofanom ca unică sursă de azot, creșterea ciupercilor nu a fost observat, dar cu adăugarea de 500 mg l / -triptofan - mediu cu succinat de amoniu
ieșire ergotoxine în cultura de 35 de zile aproape sa dublat. Nu a existat o creștere fungică pe un mediu care conține acid tartric, acidul fosforic, acidul acetic, dar un bun ergotoxine randament obținut în mediu suplimentat cu acid succinic. Autorii au constatat că sinteza raportului surse de carbon ergotoxine afectează în mod semnificativ (galactoză) și fosfor (tabelul. 2).
Tabelul 2
Efectul raportului galactoză și fosfor în formarea de alcaloizi Claviceps purpurea

Pe baza studiilor a stabilit o rată tipică de creștere ciuperci și formarea de alcaloizi. Acestea din urmă se produce atunci când epuizarea principalelor componente ale mediului, și o perioadă considerabilă (20 de zile), creșterea miceliului (Fig. 14).

Fig. 14. Creștere și educație ergotalcaloizi purpurea Claviceps în cultură saprofite pe mediu cu galactoză.
Tulpinile C /, purpurea difera in capacitatea de a forma alcaloizilor cu mediu de creștere cu diferite zaharuri și surse de azot. 10 tulpini testate alcaloizilor formate cu o creștere pe mediu cu galactoză, 8 - pe un mediu care conține zaharoză și o singură tulpină - pe un mediu cu lactoză.
Tulpinile studiate diferă de asemenea în domeniul de utilizare a zahărului: o tulpină formată alcaloizii folosind cinci zaharuri, cele trei - folosind patru etc. Cu toate acestea, relația directă dintre capacitatea de a utiliza zahăr și formarea de alcaloizii au fost observate ... Din cele cinci tulpini C /. purpurea doi alcaloizii sunt formate în timpul creșterii mediului cu succinat de amoniu, trei - cu creșterea mediului cu extract de drojdie și nici unul - atunci când este crescută pe un mediu cu asparagină.
Notând diferitele tulpini de / activitate C, purpurea și influența mediului asupra randamentului și compoziția de ansamblu ergotoxine. Adăugarea de tiamină și cisteină crește ușor randamentul total de alcaloizi. Condiții favorabile pentru creșterea miceliului, nu este întotdeauna propice pentru biosinteza de toxine (Voigt, Keipert, 1967). există o semnificativă
Inhibarea biosintezei toxinelor în atmosferă de deuteriu (Mrtek et al., 1967).
Tayberg Vaning și au prezentat schimbări în componentele miceliu C /. purpurea, care apar în timpul perioadei de creștere, în legătură cu formarea de ergotalcaloizi în funcție de diferite concentrații de fosfat în mediu, surse de azot și adaptarea procesului de inocul pentru utilizare galactoză (Taber, Vining, 1963).
Aceste rezultate sugerează că intensitatea creșterii miceliului nu este un factor comun de reglementare formarea ergotalcaloizi. Culturile miceliene înainte de formarea de toxine acumulate polioli, glucide, lipide și rămâne concentrație ridicată de azot solubil în apă și ARN.
creșterea miceliului Amplification la o concentrație ridicată de fosfat în mediu nu este însoțită de o creștere a formării ergotalkaloidov- cel mai mare conținut de azot total înregistrat atunci când este crescută pe un mediu cu o concentrație scăzută de fosfat. acumularea de ARN și azotul solubil în apă este cel mai caracteristic formarea indicelui ergotalcaloizi.
Pe baza acestui fapt, autorii cred că formarea ergotalcaloizi are loc în timpul fazei de tranziție de creștere, caracterizată printr-o continuare a acumulării de azot, dar nu rezerve carbohidrați. In studiul de cromatografie de zaharuri și polioli miceliu C /. purpurea constatat că componentele principale și de rezervă ale sale constante sunt trehaloză și manitol, prezența altor glucide (glucoza, arabitol, glicerol, dulcitol) depinde de compoziția mediului nutritiv pentru cultivarea ciupercii (fig. 15).
Acesta a arătat un efect semnificativ al componentelor anorganice ale mediului - diferitelor săruri minerale și oligoelemente - creșterea și formarea de alcaloizi număr lisergic (Rosarra et al, 1967.).
Autorii au folosit tulpini de Claviceps paspali, formând acidul lisergic și derivații săi. În special, acesta are un efect semnificativ al compoziției minerale a apei de la robinet formarea de alcaloizi, în legătură cu care mediul recomandat de compoziția specială a sărurilor minerale stimulează sinteza alcaloizilor acidului lisergic.
Autorii au fost selectate tulpina C /. paspali, care prin cultivarea ciupercii în aceste medii formate din mai mult de 1000 de alcaloizii mcg per 1 ml mediu.
În prima etapă de creștere a ciupercii a fost cultivată într-un mediu bazic, cu 4% manitol, 1% acid succinic și oligoelemente, în al doilea - pe mediu ce conține 5% manitol și 3% acid succinic. În etapa a treia a fost determinată de alcaloizii de creștere și de formare în funcție de prezența unor săruri minerale și oligoelemente: Ca (N03) 2 - * H2OJ (l, 27 • 10-3), MgS04 • 7H20 (3,25 x X KG3), ZnS04 • 7H20 (1,74 • KG5), FeS04 • 7H20 (1-80 • 1 (T4), CuS04 • 5H20 (2,01 • 1 (P5), MnS04 • 4H20 (4,48 • 10-5), naNO,
(1,19 • 10'3), KH2P04 (7,35 • 10 3), în moli pe litru. Se constată că pentru tulpina C /, este nevoie de paspali de potasiu și magneziu pentru creșterea miceliului a fost aceeași ca în alkaloidoobrazovanii.

Fig. 15. Compoziție Schimbarea zaharuri endogene și polioli în miceliu
Claviceps purpurea, în funcție de compoziția mediului de cultură:
și - glucoză și amoniu succinat, b - galactoză și amoniu succinat, D-manoză și amoniu succinat r manitol și succinat de amoniu.
creștere maximă observată la concentrații mai mici de fosfor, fier, zinc, decât în ​​formarea de alcaloizi. Mangan și cupru afectează în mod semnificativ sinteza alcaloizilor (Fig. 16).
Shalagina și colaboratorii (1965) au studiat formarea alcaloizilor în 32 de tulpini C /. purpurea, izolate de ierburi scleroți, grâu, secară în diferite regiuni geografice ale URSS. Ciupercile au fost cultivate într-o cultură de suprafață pe un mediu cu următoarea compoziție: Sucroză - 75 Sorbitol - 25, citrat de amoniu - 5, KH2P04 - 0,25, Ca (On3) 2 - 1,5, MgS04 - 0,25 (în g l!) , KS1 - 0125, ZnS04 - H20 - 0,00003, FeS04. 7H20 - 0,03, cisteină - 0,01, aneurine - 0,0001, biotina - 0,000001 (pH 6,5). Prezența toxinelor în miceliu a fost determinată în jumătate până la două luni de cultură. Majoritatea tulpinilor studiate în aceste condiții și au format ergocriptina din urmă ergotamin- a predominat, acesta sa ridicat la 80% din randamentul total de alcaloizi.

Fig. 16. Efectul microelementelor asupra creșterii miceliului și formarea ergotalcaloizi în cultura saprofite Claviceps paspali:
și - potasiu, b - fosfor - magneziu, g - sulf, d - fier, e - zinc, w - mangan
h - cupru (1 - miceliu, 2 - alcaloizi de ergot).
Conținutul lor totală egală cu aproximativ 0,03% raportat la greutatea uscată a miceliu (Tabelul 3)..
TABELUL 3
alcaloizii de compoziție formate din diferite tulpini de purpurea CL

Castagnoli și Mantle (Costaghnoli, Mantale, 1966) a examinat structura alcaloid format în cultura saprofite tulpini C /, purpurea, izolat din diferite ierburi. Sa demonstrat că tulpina izolată din Spartina townsendii la 8,5 pH se extrage cu cloroform din filtrat 40% toxine restul - butanol la pH 3,5. a fost obținut Cromatografia extractului cloroform pe hârtie și un strat subțire de silicagel într-o cantitate mare, iar henoklavin minor - elimoklavin și ergotoxine. Cromatografia n-butanol extracte autori au descoperit că tulpina-d lisergic acidului și izomerul acidului său 6-metilergol-8-greu-8-carboxil. acid d lisergic într-o cantitate mică a fost izolat anterior din filtrații tulpinilor C /, purpurea, izolate din Pennisetum typhoideum.
Kostanoli și Tonoli (1966) a studiat formarea ergotalcaloizi purpurea CL și C /, paspali în cultură submersă. Aceasta a constatat că în sinteza are loc cultura saprofite ergotalcaloizi în tulpinile nesporogeni (care nu formează conidia). In alkaloidobrazuyuschih tulpini active în special în cultură submersă, hife privind natura creșterii și activității funcționale au un număr de faze. Faza, caracterizată prin prezența tipic miceliu structura sklerotsialnoy celule scurte îngroșat și incluziuni abundente de grăsime, este asociat cu formarea de ergotalcaloizi.
Atunci când tulpinile cultivate C /, purpurea și CL paspali pe mediu peptonă manitol observă o creștere de cinci ori cu creșterea eliberare toxinelor din concentrația de zahăr 5 până la 25%.
Cultivarea celulelor si extractele de acelulare studiate tulpina CL purpurea in cultura saprofite cuprind enzime care transportă diferite căi ale metabolismului glucozei. Când crescut în cultură submersă pe mediu sucroză-mineral sau mediu cu uree și extract de drojdie în structurile non-celulare revelate hexokinază, glucoza-b-fosfat dehidrogenază, acid 6-phosphogluconic aldolaza enzime ale ciclului pentose (Me Donald et al., 1960). Găsit importanța radiografică relativă a diferitelor căi ale metabolismului glucozei in ciuperci: 90% glucoză celule transformate ca urmare a glicolizei și ciclul Krebs în creștere, 10% din glucoza este asimilat de ciclu fosfat pentozo-. Enzimatici cale alcaloizii de distrugere investigate prin oxidarea peroxidază de hrean (Taylor, Shough, 1967), decarboxilarea etichetat triptofan și a derivaților săi în molecula argoklavina și alimoklavina (Plieninger et al, 1967.) - a identificat reacția specifică hidroxilare enzimatică în multe specii de fungi (Beliveau, Ramstad, 1966 și colab., Orange, Goncharov, Bezborodov, 1969).
Set diferite fosfaților nevoie de ciuperci pentru creșterea maximă a miceliene și formare ergotalcaloizi. În procesul de creștere a conținutului ciuperca ortofosfat al lichidului de cultură este redus în mod semnificativ, scăderea formării de polifosfat solubil în acid, insolubilă în acid și utilizați mai întâi în legătură cu o creștere a conținutului de ARN (tab. 4).
TABELUL 4
raportul de fosfat în timpul creșterii Claviceps purpurea

* Ca procent din KH2P04 P04 exogene.

După cum se vede din tabelul. 4, o de 35 de zile de cultură CL purpurea la formarea maximă a ergotalcaloizi parte semnificativă a fosfatului exogene utilizate pentru a forma ARN. Se crede că raportul de formare a nivelului și cantitatea de polifosfați ARN insolubile în acid tipic toksinobrazuyuschego tulpina C /, purpurea. Efectul derivaților purinici și fosfați de energie în sinteza ARN și formarea ergotalcaloizi conținutului de fosfat (Waart, 1960, 1961).
Un număr de scheme biosinteza alcaloizilor clavine acidului lisergic și alcaloizilor. In experimentele cu eticheta a-triptofan po94 arătat că este un precursor al acidului lisergic. Greger (Groger și colab., 1961, 1964, 1966) a arătat că triptofanul este precursorul alcaloizilor clavine din klavinobrazuyuschih tulpinile purpurea CL in cultura saprofite. Secvența biosinteza lor urmează schema: triptofan elimoklavin henoklavin -> agroklavin elimoklavin derivați ai acidului lisergic.
Remsted și Taylor (Taylor, Ramstad, 1960), a constatat că precursorul acidului mevalonic este izo-izopentenil parte a acidului lisergic.
Plininger (Plieninger, 1965) consideră că ergotoxine biosinteză realizată după cum urmează: agroklavin elimoklavin acidului lisergic -> alcaloizi de ergot.
Kostanoli și Mantle (Costahgnoli, Mantale, 1966) au investigat catena laterală cale karbinolamidnoy biosintetice - oksietilamida acidului lisergic având similaritate structurală cu catenele laterale ale peptidei ergotamină tip alcaloid. In experimentele autorii alkaloid transformate prin piroliză în acetaldehidă și lisergic acid- amidă a arătat că multe dintre substanțele din molecula alcaloid, numai alanină și piruvatului în mare măsură încorporate în catena laterală (Tabelul 5)..
Tabelul 5
Includerea substanțelor radioactive în molecula unui-lisergic oksietilamida acidului

Mayer, Kiba și Komersova (Mayer, Kybal, Komersova, 1967) au investigat tulpini ergotoksinobrazuyuschie ergotamina și ciuperci. Atunci când creșterea lor pe un mediu care conține alanină marcată în hidrolizate ergotoxine parte semnificativă din radioactivitatea conținută în valina și leucina. metionină Labeled nu a fost inclusă în oricare dintre unitățile structurale ale lanțului peptidic. Posibile căi de sinteză a lanțurilor peptidice.